EFEITO DA ADIÇÃO DE ANTIOXIDANTES E CRIOPROTETORES NA CRIOPRESERVAÇÃO DO SÊMEN DE OVINOS

RESUMO

Este trabalho teve por objetivo determinar o efeito da adição de diferentes crioprotetores e antioxidantes ao sêmen diluído de carneiros após criopreservação. Para isto, foram coletados 10 ejaculados de 3 carneiros (n=30) e diluídos em Tris-Gema de ovo até a concentração final de 200 x 106 sptz/mL e, mantidos em banho maria a 32 °C. Os antioxidantes foram adicionados da seguinte forma controle (sem adição de antioxidantes); 100 M de melatonina (MEL) + 0,05% de ácido ascórbico (AA); 100 M de MEL + 90 L de Trolox C (TRO); 90 L de TRO + 0,05% de AA; e 100 M de MEL + 0,05%AA + 90 L de TRO. Depois, o sêmen foi resfriado, envasado e lacrado em palhetas de 0,5 mL e congelado em N2L. As amostras foram analisadas quanto à motilidade espermática, integridade da membrana plasmática e da membrana acrossomal, atividade mitocondrial, teste de ligação e a quantificação do estresse oxidativo. As variáveis foram submetidas à análise de variância e medias comparadas pelo teste de Tukey a 5% de probabilidade. A motilidade (total e progressiva) foi maior (P<0,05) quando adicionado a associação MEL+AA+TRO (67% e 49,89%), MEL+AA (64,37% e 45,61%) e MEL+TRO (61,65% e 41,15%) comparado ao tratamento controle (55,52% e 36,54%) e TRO+AA (57,07% e 38,40%). A adição de MEL+AA+TRO ao sêmen diluído manteve (P<0,05) a integridade da membrana plasmática (30,75%) e acrossomal (84,53%) dos espermatozoides quando comparado ao tratamento controle (15,60 e 68,16%, respectivamente), além de ter promovido maior (P<0,05) atividade mitocondrial (96,43%) quando comparado aos demais tratamentos. O número de espermatozoides que apresentaram à capacidade de ligação a membrana perivitelina da gema de ovo foi maior (P<0,05) no sêmen tratado com as diferentes associações de antioxidante quando comparado ao controle, sendo a associação MEL+AA+TRO (178,36%) superior (P<0,05) aos demais tratamentos. Não houve diferença (P>0,05) entre os tratamentos quanto a quantidade de espécies reativas ao ácido tiobarbitúrico produzidos. Foi realizado um segundo experimento para determinar se L-prolina (Pro) e L-glutamina (Glu) beneficiaram os espermatozóides ovinos durante a criopreservação. Foram utilizados trinta e dois ejaculados diluídos em Tris-Gem-Glicerol (200x106 espermatozóides/mL) e tratados com diferentes concentrações de aminoácidos controle; Pro + Glu 1 100 M Pro + 500 M Glu; Pro + Glu 2 300 M Pro + 1000 M Glu; Pro + Glu 3 500 M Pro + 1500 M Glu; e Pro + Glu 4 700 M Pro + 2000 M Glu, após o qual o semen foi resfriado e congelado. O sêmen tratado com Pro + Glu 3 exibiu a maior motilidade após a descongelação. O PMI e o IAM foram maiores nos grupos Pro + Glu 1, Pro + Glu 2 e Pro + Glu 3, e Pro + Glu 2 e Pro + Glu 3, respectivamente. Os aminoácidos também mantiveram alta atividade mitocondrial em comparação ao controle, com Pro + Glu 3 resultando em uma maior atividade. A viabilidade dos espermatozoides foi maior no grupo Pro + Glu 2 e Pro + Glu 3 do que no controle. O número de espermatozoides que apresentaram à capacidade de ligação a membrana perivitelina da gema de ovo foi maior no sêmen tratado com as diferentes associações de aminoácidos quando comparado ao controle. Posterioremente, o terceiro experimento avaliou a adição de diferentes concentrações de colesterol carreado por ciclodextrina, utilizando a mesma metodologia do primeiro experimento, porém utilizando o colesterol carreado com ciclodextrina (CCC) adicionado da seguinte forma controle (sem adição do CCC); 1,5 mg de CCC; 3,0 mg de CCC; e 6,0 mg de CCC. Após adição do CCC, o sêmen foi resfriado e congelado. As amostras foram analisadas quanto à motilidade espermática, integridade da membrana plasmática e da membrana acrossomal, atividade mitocondrial e teste de ligação. As variáveis foram submetidas à ANOVA e médias comparadas pelo teste de Tukey a 5% de probabilidade. O maior percentual de integridade da membrana plasmática e a maior atividade mitocondrial foram obtidos utilizando 6,0 mg de CCC. A adição de 3,0 mg de CCC manteve o percentual de motilidade espermática após a criopreservação, quando comparado aos demais tratamentos com CCC e controle. A adição de 1,5 e 3,0 mg de CCC mantiveram o percentual de viabilidade espermática acima de 65%. O número de espermatozoides que apresentaram à capacidade de ligação a membrana perivitelina da gema de ovo foi maior (P<0,05) no sêmen tratado com 3,0 mg de CCC. Em conclusão, adição de MEL+AA+TRO, 500 M de L-prolina e 1500 M de L-glutamina e de CCC ao sêmen diluído de carneiros, nas doses avaliadas, melhora a qualidade espermática após descongelação.

ABSTRACT

This work aimed to determine the effect of adding different cryoprotectants and antioxidants to diluted sheep semen after cryopreservation. For this, 10 ejaculates were collected from 3 sheep (n = 30) and diluted in Tris-Yolk until the final concentration of 200 x106 sptz / mL and kept in a water bath at 32 ° C. Antioxidants were added as follows control (no antioxidants added); 100 M melatonin (MEL) + 0.05% ascorbic acid (AA); 100 M HONEY + 90 L Trolox C (TRO); 90 L TRO + 0.05% AA; and 100 M HONEY + 0.05% AA + 90 L TRO. Then, the semen was cooled, packaged and sealed in 0.5 mL straws and frozen in N2L. The samples were analyzed for sperm motility, plasma membrane and acrosomal membrane integrity, mitochondrial activity, binding test and quantification of oxidative stress. The variables were subjected to analysis of variance and means compared by Tukey's test at 5% probability. Motility (total and progressive) was higher (P <0.05) when added the association MEL + AA + TRO (67% and 49.89%), MEL + AA (64.37% and 45.61%) and MEL + TRO (61.65% and 41.15%) compared to the control treatment (55.52% and 36.54%) and TRO + AA (57.07% and 38.40%). The addition of MEL + AA + TRO to the diluted semen maintained (P <0.05) the integrity of the plasma membrane (30.75%) and acrosomal (84.53%) of the spermatozoa when compared to the control treatment (15.60 and 68.16%, respectively), in addition to promoting greater (P <0.05) mitochondrial activity (96.43%) when compared to other treatments. The number of sperm that showed the ability to bind to the egg yolk perivitellin membrane was higher (P <0.05) in the semen treated with different antioxidant associations when compared to the control, being the association MEL + AA + TRO (178 , 36%) higher (P <0.05) than the other treatments. There was no difference (P> 0.05) between treatments regarding the amount of species reactive to thiobarbituric acid produced. A second experiment was carried out to determine whether L-proline (Pro) and L-glutamine (Glu) benefited sheep sperm during cryopreservation. Thirty-two ejaculates diluted in Tris-Gem-Glycerol (200x106 sperm / mL) and treated with different concentrations of amino acids were used control; Pro + Glu 1 100 M Pro + 500 M Glu; Pro + Glu 2 300 M Pro + 1000 M Glu; Pro + Glu 3 500 M Pro + 1500 M Glu; and Pro + Glu 4 700 M Pro + 2000 M Glu, after which the semen was cooled and frozen. Semen treated with Pro + Glu 3 exhibited the greatest motility after thawing. PMI and AMI were higher in the groups Pro + Glu 1, Pro + Glu 2 and Pro + Glu 3, and Pro + Glu 2 and Pro + Glu 3, respectively. Amino acids also maintained high mitochondrial activity compared to the control, with Pro + Glu 3 resulting in greater activity. Sperm viability was higher in the Pro + Glu 2 and Pro + Glu 3 group than in the control group. The number of sperm that showed the ability to bind to the egg yolk perivitellin membrane was higher in the semen treated with the different associations of amino acids when compared to the control. Subsequently, the third experiment evaluated the addition of different concentrations of cholesterol carried by cyclodextrin, using the same methodology as the first experiment, but using cholesterol carried with cyclodextrin (CCC) added as follows control (without adding CCC); 1.5 mg CCC; 3.0 mg CCC; and 6.0 mg of CCC. After adding the CCC, the semen was cooled and frozen. The samples were analyzed for sperm motility, plasma membrane and acrosomal membrane integrity, mitochondrial activity and binding test. The variables were submitted to ANOVA and averages compared by the Tukey test at 5% probability. The highest percentage of plasma membrane integrity and the highest mitochondrial activity were obtained using 6.0 mg of CCC. The addition of 3.0 mg of CCC maintained the percentage of sperm motility after cryopreservation, when compared to other treatments with CCC and control. The addition of 1.5 and 3.0 mg of CCC maintained the percentage of sperm viability above 65%. The number that of spermatozoa that showed the ability to bind to the egg yolk perivitellin membrane was higher (P <0.05) in semen treated with 3.0 mg of CCC. In conclusion, the addition of MEL + AA + TRO, 500 M of L-proline and 1500 M of L-glutamine and CCC to the diluted semen of sheep, in the evaluated doses, improves the sperm quality after thawing.