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Tese em Português | VETTESES | ID: vtt-220811

Resumo

As infecções por nematoides gastrintestinais (NGI) são um dos principais entraves à ovinocaprinocultura mundial. O controle dessas infecções utilizando anti-helmínticos sintéticos tem colaborado com a seleção de populações de nematoides multirresistentes. Assim, a busca por alternativas de controle torna-se necessária, destacando-se a fitoterapia. Diversas plantas, como a Calotropis procera, são utilizadas tradicionalmente para fins anti-helmínticos, o que estimula a validação científica deste efeito e a investigação de sua segurança toxicológica. Dessa forma, objetivou-se avaliar a composição química, o potencial anti-helmíntico e a segurança toxicológica do látex de C. procera (LCp). Para tanto, foram obtidas três frações distintas de LCp por meio de processos baseados em centrifugação e liofilização (podendo incluir etapa de diálise): fração precipitada denominada LCp-ppt; fração sobrenadante rica em metabólitos secundários, denominada inicialmente como LNP (Látex Não Proteico) e depois como LCp-fs (Fração solúvel de LCp); e fração sobrenadante rica em proteínas, denominada PLCp (proteínas do látex de C. procera). As frações de LCp foram submetidas a análises químicas e/ou bioquímicas como Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (CLAE), Espectroscopia no Infravermelho por Transformada de Fourier (FTIR), dosagem de proteínas e verificação da atividade enzimática. LCp-fs e PLCp foram submetidos à testes in vitro para verificar seu efeito sobre ovos, larvas e o nematoide adulto de Haemonchus contortus (Teste de Motilidade dos Nematoides Adultos - TMNA). Parasitas coletados no TMNA foram submetidos à microscopia eletrônica de varredura (MEV) e de transmissão (MET) para verificar alterações em sua ultraestrutura. A segurança toxicológica de LCp-fs e PLCp foi verificada em testes de toxicidade aguda. Ensaio de toxicidade subcrônica foi também realizado para LCp-fs. A atividade anti-helmíntica de LCp-fs e PLCp foi avaliada em ovinos, usando o teste de eficácia anti-helmíntica controlado (TEAC) e o teste de redução da contagem de ovos nas fezes (TRECOF), respectivamente. Nematoides obtidos no TEAC foram submetidos à MET. Testes fitoquímicos em LCp-fs indicaram a presença de fenóis, esteroides, alcaloides e cardenolídeos, e a presença dos compostos ácido gálico e quercetina foi caracterizada pela CLAE. O conteúdo de proteínas em PLCp foi de 43,1 ± 1,1 mg/mL e em LCp-fs foi de 7,7 ± 0,3 mg/mL. LCp-fs e PLCp (8 mg/mL) apresentaram média de inibição da eclosão de ovos de 90% e 85%. A inibição média do desenvolvimento larvar foi de 95% e 88% para LCp-sf e PLCp (1 mg/mL). No TMNA, LCp-sf e PLCp inibiram a motilidade de 100% dos nematoides após 6 e 24 h, respectivamente, e foram observadas alterações na ultraestrutura desses nematoides. A administração de dose única de LCp-fs (DL50 = 4031.5 mg/kg) ou PLCp (DL50 > 5000 mg/kg) em camundongos apresentou segurança. Sinais de toxicidade foram observados em ratos tratados por 30 dias com LCp-fs. Ovinos tratados com LCp-fs ou PLCp apresentaram redução de 30% na carga de H. contortus e de 69% de ovos de NGI nas fezes, respectivamente. Conclui-se que as frações do látex de C. procera estudadas, apresentaram segurança toxicológica e potencial anti-helmíntico, entretanto mais investigações são necessárias para sua adoção no controle de NGI em pequenos ruminantes.

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Infections with gastrointestinal nematodes (NGI) are one of the main obstacles to sheep and goats worldwide. The control of these infections using synthetic anthelmintics has collaborated with the selection of multiresistant nematode populations. Thus, the search for control alternatives is necessary, especially phytotherapy. Several plants, such as Calotropis procera, are traditionally used for anthelmintic purposes, which stimulates the scientific validation of this effect and the investigation of its toxicological safety. Thus, the objective was to evaluate the chemical composition, the anthelmintic potential and the toxicological safety of the C. procera latex (CpL). For this purpose, three distinct fractions of CpL were obtained through processes based on centrifugation and lyophilization (which may include a dialysis step): precipitated fraction called CpL-ppt; supernatant fraction rich in secondary metabolites, initially called LNP (Latex Non-Protein) and then as CpL-sf (soluble fraction of CpL); and supernatant fraction rich in proteins, called LPCp (latex proteins of C. procera). The CpL fractions were subjected to chemical and/or biochemical analyzes such as High performance liquid chromatography (HPLC), Fourier transform infrared spectroscopy (FTIR), protein measurement and enzymatic activity verification. CpL-sf and LPCp were subjected to in vitro tests to verify their effect on eggs, larvae and the adult nematode of Haemonchus contortus (Adult word motility test - AWMT). Parasites collected at AWMT were subjected to scanning electron microscopy (SEM) and transmission (TEM) to verify changes in their ultrastructure. The toxicological safety of CpL-sf and LPCp has been verified in acute toxicity tests. Subchronic toxicity assay was also performed for CpL-sf. The anthelmintic activity of CpL-sf and LPCp was evaluated in sheep, using the controlled anthelmintic efficacy test (CAET) and the fecal egg count reduction test (FECRT), respectively. Nematodes obtained from CAET were submitted to TEM. Phytochemical tests in CpL-sf indicated the presence of phenols, steroids, alkaloids and cardenolides, and the presence of the compounds gallic acid and quercetin was characterized by HPLC. The protein content in LPCp was 43.1 ± 1.1 mg / mL and in CpL-sf it was 7.7 ± 0.3 mg/mL. CpL-sf and LPCp (8 mg/mL) showed mean egg hatch inhibition of 90% and 85%. The mean inhibition of larval development was 95% and 88% for CpL-sf and LPCp (1 mg/mL). In AWMT, CpL-sf and LPCp inhibited the motility of 100% of the nematodes after 6 and 24 h, respectively, and changes in the ultrastructure of these nematodes were observed. Administration of a single dose of CpL-sf (LD50 = 4031.5 mg / kg) or LPCp (LD50 > 5000 mg/kg) in mice was safe. Signs of toxicity were observed in rats treated for 30 days with CpL-sf. Sheep treated with CpL-sf or LPCp showed a 30% reduction in the burden of H. contortus and a 69% reduction in NGI eggs in feces, respectively. It is concluded that the fractions of the C. procera latex studied, presented toxicological safety and anthelmintic potential, however more investigations are necessary for its adoption in the control of NGI in small ruminants.

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