EXPOSIÇÃO DE FOLÍCULOS PRÉ-ANTRAIS CAPRINOS AO VITANOLIDO D: ANÁLISE E TENTATIVA DE REDUÇÃO DOS EFEITOS TÓXICOS USANDO A MELATONINA

RESUMO

O vitanolido D (VD) tem sido mencionado como um potencial candidato a quimioterápico, porém seus efeitos tóxicos podem ser deletérios à reserva folicular ovariana, comprometendo a fertilidade feminina. Por outro lado, a associação do VD a substâncias citoprotetoras como a melatonina (MT) poderá minimizar os efeitos indesejáveis. O objetivo deste estudo foi avaliar se a MT é capaz de atenuar os efeitos do VD sobre folículos pré-antrais (primordiais e em desenvolvimento) caprinos in situ (fase I) ou folículos secundários isolados (fase II). Para isso, foram avaliados a morfologia e desenvolvimento folicular, bem como a expressão de proteínas envolvidas nos danos ao DNA (ATM e H2AX), apoptose (caspase-3 ativa) ou defesa do oócito (TAp63). Na fase I, fragmentos ovarianos foram incubados por 48 h na presença de (1) - MEM; (2) -MEM + 6 M de VD; (3) -MEM + 3 mmol/L de MT e (4) -MEM + 6,0 M de VD + 3 mmol/L de MT. Na fase II, folículos secundários isolados foram incubados por até 96 h em (1) apenas meio de cultivo (-MEM++/-MEM++); (2) -MEM++ + 3 mmol/L (MT/MT); (3) -MEM++ por até 48 h, seguido por mais 48 h de incubação na presença do VD 6 M (-MEM++/WD) ou (4) de MT 3 mmol/L por até 48 h, seguido por mais 48 h de exposição ao VD 6 M e MT 3 mmol/L (MT/MT + WD). Os resultados revelaram uma redução no percentual de folículos pré-antrais (in situ) normais após 48h de exposição ao VD ou VD + MT comparada às condições in vivo ou controle. O diâmetro dos folículos primordiais expostos ao VD foi reduzido, comparado aos demais tratamentos. Na fase II, foi observada uma redução no percentual de folículos secundários normais expostos ao VD e à MT, associados. Além disso, o diâmetro folicular na presença do VD sozinho ou associado à MT foi reduzido. No tocante à expressão de proteínas, na fase I, o percentual de folículos positivamente marcados para ATM foi maior na presença das drogas, enquanto que a marcação para H2AX, na presença do VD foi superior ao controle ou à MT. Na fase II, foi observada marcação positiva para ATM, H2AX em folículos isolados de todos os tratamentos. Resultados similares foram observados para a TAp63 nos folículos das fases I e II. Em conclusão, este estudo mostrou que a melatonina não conferiu proteção aos folículos pré-antrais e pode ter aumentado o efeito tóxico do VD aos folículos presentes ou fora do córtex ovariano.

ABSTRACT

The withanolide D (WD) is a candidate to chemotherapeutic of phytotherapeutic origin with high toxicity on tumor and healthy cells. However, the use of melatonin (MT) as a protector agent against damages caused by WD on ovarian function was not yet investigated. The aim of the present study was to evaluate if melatonin is able of mitigating toxic effects of WD exposure to preantral follicles in situ (phase I) or isolated secondary follicles (phase II) on follicular morphology and development, as well as damage to DNA. In phase I, fragments were exposed to WD for 48 h in the following treatments (1) -MEM; (2) -MEM plus 6 M WD; (3) - MEM plus 3 mmol/L MT or (4) -MEM plus 6,0 M WD and 3 mmol/L MT. In phase II, secondary follicles were exposed for until 96 h in (1) only to basic medium (-MEM++/- MEM++); (2) -MEM++ plus 3 mmol/L MT (MT/MT); (3) -MEM++ until 48 h, followed by more 48 h in 6 M WD (-MEM++/WD) or (4) a pre-exposure to 3 mmol/L MT for until 48 h, followed by more 48 h of exposure to 6 M WD plus 3 mmol/L MT (MT/MT + WD). In phase I, it was a reduction in the percentage of normal preantral follicles after 48 h of exposure to WD or WD + MT compared to control. The diameter of primordial follicles exposed to WD was lower than that of primordial follicles from other treatments. In addition, the percentage of positively stained follicles for ATM was higher in the presence of drugs, whereas for H2AX, in the presence of WD, the percentage of stained follicles was higher than control and MT. In phase II, it was observed a reduction in the percentage of normal follicles exposed to WD and MT associated. Furthermore, the diameter of follicles exposed to WD and to MT, alone or associated, was reduced. It was observed positive staining for ATM, H2AX and TAp63 in isolated follicles in all treatments. In conclusion, this study shows that WD was toxic during exposure of caprine preantral follicles in situ and melatonin was not able of exert a cytoprotector effect. Moreover, pre-exposure to melatonin followed by exposure to WD of isolated secondary follicles negatively affects follicular survival and growth.