Análise do óleo essencial de Origanum majorana relacionada ao seu potencial tóxico e antineoplásico

RESUMO

O câncer é apontado como um problema de saúde pública de proporções mundiais, 11 uma vez que as taxas de incidência são crescentes, a mortalidade é alta e as 12 opções de tratamento farmacológico disponíveis apresentam efeitos adversos 13 graves e vêm perdendo sua eficácia ao longo do tempo, devido ao desenvolvimento 14 de mecanismos de resistência pelas células neoplásicas. Frente a essa realidade, a 15 indústria farmacêutica tem nas plantas medicinais um amplo painel de moléculas 16 potencialmente eficazes e menos tóxicas a serem estudadas. A tualmente já está 17 cientificamente comprovado qu e os compostos químicos presentes nas plantas 18 medicinais podem proteger as células de eventos carcinogênicos, agindo contra a 19 promoção e a progressão tumorais. Porém, os mesmos princípios ativos que 20 conferem as propriedades terapêuticas a essas plantas, ta mbém podem ser os 21 responsáveis pelos seus efeitos tóxicos e reações adversas. Nesse contexto, o 22 presente trabalho tem como objetivos estudar a citotoxicidade do óleo essencial de 23 Origanum majorana (OEOM) em células espermáticas suínas e hemácias e o seu 24 me canismo de ação intracelular em linhagens celulares não neoplásicas (MDBK 25 Madin Darby Bovine Kidney) e neoplásicas (B16F10 melanoma murino) e 26 determinar a sua composição química. A determinação da toxicidade do OEOM in 27 vitro foi avaliada nas células es permáticas através de parâmetros de cinética (CASA 28 = Computer Assisted Sperm Analisys) e de estrutura (citometria de fluxo), o 29 mecanismo de ação nas células MDBK e B16F10 foi avaliado por citometria de fluxo, 30 e a atividade hemolítica em eritrócitos caninos , pelo teste em meio líquido e em meio 31 sólido com ágar sangue de ovinos. Para a identificação dos compostos químicos do 32 óleo essencial foi utilizado cromatógrafo a gás acoplado a detector de massas 33 (GC/MS QP 2010SE Shimadzu, Japão), equipado com auto injet or AOC 20i. As 34 quantificações foram feitas por área normatizada e as identificações dos compostos 35 pelo espectrômetro de massas, utilizando a biblioteca NIST 8 do GC/MS. O OEOM é 36 composto majoritariamente por terpenos, principalmente por gama terpinen o , cis 37 sabineno hidratado e 4 terpineol. Na avaliação imediata da cinética espermática o 38 OEOM reduziu a motilidade total (MT) e progressiva (MP) e a distância média 39 percorrida (DAP) em todas as concentrações testadas, enquanto que, após 24 horas, 40 as concentraçõe s tóxicas foram de 1 a 4 mg.mL 1 . Na citometria de fluxo, as 41 estruturas afetadas foram as mitocôndrias (PMM) em todas as concentrações e a 42 membrana, que teve a sua fluidez reduzida com 0,25 e 1 mg.mL 1 de OEOM. As 43 concentrações de OEOM capazes de provocar hemólise em ambos os tipos 44 celulares foram 1, 2 e 4 mg.mL 1 , chegando a percentuais de 90 a 100% de hemólise. 45 Nos testes com a linhagem celular MDBK observou se redução de espécies reativas 46 de oxigênio (ERO)e lipoperoxidação (LPO) em todas as concentrações de oxigênio (ERO)e lipoperoxidação (LPO) em todas as concentrações utilizadas de utilizadas de 1 OEOM, nas células MDBK, e também na fase S do ciclo celular. Nas células B16F10, OEOM, nas células MDBK, e também na fase S do ciclo celular. Nas células B16F10, 2 os tratamentos com o OEOM reduziram ERO e as células em fase G2 e os tratamentos com o OEOM reduziram ERO e as células em fase G2 e 3 aumentaram as células na fase S. As concentrações de 0,25 e 0,5 mg.mLaumentaram as células na fase S. As concentrações de 0,25 e 0,5 mg.mL--1 1 4 causaram redução na flcausaram redução na fluidez e aumento do potencial de membrana mitocondrial, uidez e aumento do potencial de membrana mitocondrial, 5 respectivamente na linhagem MDBK, enquanto LPO nas células B16F10 diminuíram respectivamente na linhagem MDBK, enquanto LPO nas células B16F10 diminuíram 6 na concentração de 0,5 mg.mLna concentração de 0,5 mg.mL--11.. Os resultados obtidos nesse estudo apontam para Os resultados obtidos nesse estudo apontam para 7 a elevada toxicidade celular demonstrada, pra elevada toxicidade celular demonstrada, principalmente, nas concentrações entre incipalmente, nas concentrações entre 8 1 e 4 mg.mL1 e 4 mg.mL--11 do OEOM nas células espermáticas suínas e nas hemácias. Quanto do OEOM nas células espermáticas suínas e nas hemácias. Quanto 9 ao mecanismo de ação do OEOM, é possível supor que seu efeito seja citostático ao mecanismo de ação do OEOM, é possível supor que seu efeito seja citostático 10 para as células neoplásicas utilizadas, devido à interferênciapara as células neoplásicas utilizadas, devido à interferência no ciclo celular, sem no ciclo celular, sem 11 exercer efeitos tóxicos na linhagem MDBK, uma vez que os parâmetros relacionados exercer efeitos tóxicos na linhagem MDBK, uma vez que os parâmetros relacionados 12 à membrana plasmática e produção e ERO reduziram. A viabilidade celular não foi à membrana plasmática e produção e ERO reduziram. A viabilidade celular não foi 13 alterada em nenhuma das linhagens utilizadas nos testes. Considerando osalterada em nenhuma das linhagens utilizadas nos testes. Considerando os 14 resultados desse estudo, concluiresultados desse estudo, conclui--se que o OEOM é uma promissora fonte de se que o OEOM é uma promissora fonte de 15 moléculas com potencial terapêutico para o tratamento do câncer, uma vez que é moléculas com potencial terapêutico para o tratamento do câncer, uma vez que é 16 capaz de promover a interrupção da proliferação celular da linhagem neoplásica, capaz de promover a interrupção da proliferação celular da linhagem neoplásica, 17 mesmo em concentrações mesmo em concentrações baixas. A toxicidade apresentada pelo OEOM nas células baixas. A toxicidade apresentada pelo OEOM nas células 18 sanguíneas e espermáticas foi mais evidente nas concentrações mais elevadas e sanguíneas e espermáticas foi mais evidente nas concentrações mais elevadas e 19 não foi observada nas células MDBK.não foi observada nas células MDBK.

ABSTRACT

Cancer is identified as a public health problem of worldwide proportions, since 12 incidence rates are increasing, mortality is high and the pharmacological treatment 13 options available have serious adverse effects and have been losing their 14 effectiveness over time due to the development of resistance mechanisms by 15 neoplastic cells. Faced with this reality, the pharmaceutical industry has in medicinal 16 plants a wide panel of potentially effective and less toxic molecules to be studied. It is 17 now scientifically proven that chemical compounds present in medicinal plants can 18 protect cells from carcinogenic events, acting against tumor promotion and 19 progression. However, the same active ingredients that give therapeutic properties to 20 these plants, may also be responsible for their toxic effects and adverse reactions. In 21 this context, the present work aims to study the cytotoxicity of the essential oil of 22 Origanum majorana (OEOM) in swine sperm cells and red blood cells and its 23 mechanism of intracellular action in non-neoplastic (MDBK - Madin Darby Bovine 24 Kidney) and neoplastic cell lines ( B16F10 - murine melanoma) and determine its 25 chemical composition. The determination of OEOM toxicity in vitro was evaluated in 26 sperm cells through kinetic parameters (CASA = Computer Assisted Sperm 27 Analyzes) and structure (flow cytometry), the mechanism of action in MDBK and 28 B16F10 cells was evaluated by flow cytometry. , and hemolytic activity in canine 29 erythrocytes, by testing in liquid and solid media with sheep blood agar. For the 30 identification of the chemical compounds of the essential oil, a gas chromatograph 31 coupled to a mass detector (GC / MS-QP 2010SE-Shimadzu, Japan) was used, 32 equipped with an AOC-20i auto injector. The quantifications were made by 33 standardized area and the identification of the compounds by the mass spectrometer, 34 using the NIST 8 library of the GC / MS. OEOM is composed mainly of terpenes, 35 mainly gamma-terpineno, cis-sabinene hydrate and 4-terpineol. In the immediate 36 evaluation of sperm kinetics, OEOM reduced total (MT) and progressive (MP) motility 37 and average distance traveled (DAP) in all concentrations tested, whereas, after 24 38 hours, toxic concentrations were 1 to 4 mg.mL -1. In flow cytometry, the affected 39 structures were the mitochondria (PMM) in all concentrations and the membrane, 40 which had its fluidity reduced with 0.25 and 1 mg.mL-1 of OEOM. The concentrations 41 of OEOM capable of causing hemolysis in both cell types were 1, 2 and 4 mg.mL-1, 42 reaching percentages of 90 to 100% of hemolysis. In tests with the MDBK cell line, a 43 reduction in reactive oxygen species (ROS) and lipoperoxidation (LPO) was 44 observed in all concentrations of OEOM used in MDBK cells, and also in the S phase 45 of the cell cycle. In B16F10 cells, treatments with OEOM reduced ROS and G2 cells 1 and increased cells in S phase. The concentrations of 0.25 and 0.5 mg.mL-1 caused 2 a reduction in fluidity and an increase in membrane potential mitochondrial, 3 respectively in the MDBK lineage, while LPO in B16F10 cells decreased in the 4 concentration of 0.5 mg.mL-1. The results obtained in this study point to the high 5 cellular toxicity demonstrated, mainly, in the concentrations between 1 and 4 mg.mL-1 6 of the OEOM in the swine sperm cells and in the erythrocytes. As for the mechanism 7 of action of the OEOM, it is possible to assume that its effect is cytostatic for the 8 neoplastic cells used, due to the interference in the cell cycle, without exerting toxic 9 effects in the MDBK lineage, since the parameters related to the plasma membrane 10 and production and ERO reduced. Cell viability was not altered in any of the strains 11 used in the tests. Considering the results of this study, it is concluded that OEOM is a 12 promising source of molecules with therapeutic potential for the treatment of cancer, 13 since it is able to promote the interruption of cell proliferation of the neoplastic 14 lineage, even at low concentrations. The toxicity shown by OEOM in blood and 15 sperm cells was more evident at higher concentrations and was not seen in MDBK 16 cells.