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Tese em Português | VETTESES | ID: vtt-221014

Resumo

Aves e mamíferos possuem algumas semelhanças em seu sistema imune inato, porém também apresentam diferenças pela sua divergência evolutiva. Alguns componentes da via do interferon (IFN) estão ausentes em células de galinha, como o gene RIG-I, IRF 3 e IRF 9. Outros componentes são únicos no sistema imune inato das galinhas, como o gene do receptor do tipo Toll 15 (TLR15). A via do IFN, que possui os genes estimulados por IFN (ISGs), possui um importante papel contra os vírus, estabelecendo o estado antiviral no hospedeiro. No entanto, os mecanismos moleculares dessa indução em aves são pouco compreendidos e podem ser evolutivamente distintos dos mamíferos. Em mamíferos, uma das proteínas responsivas ao vírus e reguladas por IFN é codificada pelo gene Arf-GAP com dois domínios plaquistrinos 2 (ADAP2, também conhecido como CENTA2 e Centaurina-). A caracterização molecular e biológica da proteína ADAP2 de galinha (chADAP2) foi realizada neste estudo. Análises de bioinformática foram realizadas para identificar características da sequência de aminoácidos desta proteína e compará-las com as sequências obtidas de mamíferos. A expressão do gene chADAP2 foi calculada após a infecção em células de galinha (DF-1) com o vírus da influenza aviária (AIV) de dois subtipos (H2N1 e H5N1) em diferentes tempos. A localização da proteína chADAP2 e sua interação com a proteína MAVS de galinha (chMAVS) e grânulos de estresse (G3BP1) em células de galinhas foi acessada pela microscopia confocal e pela coimunoprecipitação. A atividade antiviral foi avaliada após a transfecção de plasmídeos expressando as proteínas de chADAP2 em células infectadas com o subtipo H9N2 do AIV. Nossos resultados mostraram que as sequências de aminoácidos da proteína ADAP2 deram origem a dois clusters (mamíferos e aves) na análise filogenética. Após a infecção com os isolados AIV houve um aumento de expressão do gene chADAP2, entre o período de 0 a 48 horas em células aviárias. A co-localização entre as proteínas chADAP2, MAVS e grânulos de estresse (G3BP1) na região citoplasmática celular foi confirmada pela microscopia confocal. A interação entre chADAP2 e chMAVS foi também comprovada pela co-imunoprecipitação. Finalmente, a atividade antiviral foi confirmada pela diminuição de infecção de AIV em células transfectadas com o plasmídeo expressando a proteína chADAP2 em células de galinha. O presente estudo identificou que a proteína chADAP2 possui um papel semelhante ao descrito pela ADAP2 em células de mamíferos, apesar da distância genética das sequências de nucleotídeos e organização dos domínios proteicos entre eles. Nossos dados confirmam a interação entre os grânulos de estresse e as proteínas da resposta antiviral, com as proteínas chADAP2 e chMAVS envolvidas na cascata para expressão de IFN tipo I. Este é o primeiro relato sobre o papel chADAP2 em células aviárias. Este novo conhecimento sobre a resposta imune inata permitirá o desenvolvimento de ferramentas para o controle de infecções virais em aves.

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Avian and mammals have some similarities in their innate immune system, but they also show differences due to their evolutionary divergence. A few components of the interferon (IFN) pathway are absent in chicken cells, such as the RIG-I gene, IRF 3, and IRF 9. Other components are unique in their innate immune system, like the tolllike receptor 15 (TLR15) gene. The IFN pathway, which has the IFN-stimulated genes (ISGs), plays a crucial role against viruses by establishing an antiviral state in the host. However, molecular mechanisms of this induction in avian are poorly understood and can be evolutionarily distinct from mammalian. In mammalian, one of the virusresponsive and IFN-regulated protein is encoded by Arf-GAP with dual PH Domain- Containing Protein 2 gene (ADAP2, also known as CENTA2 and Centaurin-). Molecular and biological characterization of chicken ADAP2 protein (chADAP2) was performed in this study. Bioinformatics analyses were performed to identify molecular features in the amino acid sequence and compare them to sequences obtained from mammals. chADAP2 gene expression was calculated after infection in chicken cells (DF-1) with avian influenza viruses (AIV) from two subtypes (H2N1 and H5N1) at different time points. The co-localization of chADAP2 protein with the chicken MAVS (chMAVS) and stress granules (G3BP1) in chicken cells was evaluated by confocal microscopy and co-immunoprecipitation. The antiviral activity was evaluated after the transfection of plasmids expressing chADAP2 protein in cells infected with AIV from H9N2 subtype. Our results showed that the ADAP2 amino acid sequences had two clusters (mammals and avian) by phylogenetic analysis. After infection with AIV isolates, an upregulation of the ADAP2 gene was detected from 0 to 48 hours in chicken cells. Confocal microscopy assays confirmed the co-localization of chADAP2, MAVS, and G3BP1 proteins in the cells' cytoplasmic region. The interaction between chADAP2 and chMAVS has been also proven by co-immunoprecipitation. Finally, the antiviral activity of the chADAP2 was confirmed by a decrease in AIV expression in cells transfected with the plasmid expressing the chADAP2 protein in chicken cells. The present study identified that chADAP2 has a similar role, as described in mammals' cells, despite their high genetic distances of nucleotide sequences and protein domains organization. Our results confirm the interaction among stress granules and antiviral response proteins, such as ADAP2 and chMAVS proteins involved in the cascade for IFN type I. This is the first report of the chADAP2 role in avian cells. This new knowledge about the innate immune response will allow the development of tools for controlling virus infections in birds.

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