ÁCIDOS GRAXOS NÃO ESTERIFICADOS (NEFAs) E BETA-HIDROXIBUTIRATO (BHBA) NA REGULAÇÃO DA FOLICULOGÊNESE E EPIGENÉTICA DAS CÉLULAS ENDOMETRIAIS

RESUMO

Um dos principais problemas abordados na pecuária de leite nas últimas décadas tem sido a redução da fertilidade em vacas de alta produção. O balanço energético negativo (BEN) durante o período pós-parto é um fator de risco para que ocorram alterações reprodutivas. Durante esse período, as concentrações séricas dos ácidos graxos não esterificados (NEFAs) e do beta-hidroxibutirato (BHBA) estão aumentadas. Essas alterações têm reflexo no microambiente folicular e endométrio bovino. Além disso, o exato mecanismo de ação dos NEFAs e BHBA nos tecidos-alvo ainda não está estabelecido, podendo ocorrer via receptores nucleares. Portanto, o objetivo do presente trabalho foi investigar a ação dos NEFAs e do BHBA na foliculogênese e no endométrio bovino, bem como investigar se os efeitos ocorrem via receptor ativado por proliferador de peroxissomo gama (PPARG). Primeiramente, investigou-se a participação do PPARG na regulação do desenvolvimento do folículo dominante e ovulação. Os resultados deste estudo revelaram que a abundância de RNAm do PPARG foi similar entre os folículos dominante e subordinado em torno da divergência folicular, diminuindo após o pico de LH e aumentando antes da ovulação. Além disso, a ativação do PPARG com Troglitazone (TGZ; agonista do PPARG) inibiu o crescimento folicular e diminuiu a expressão de RNAm da CYP19A1 nas células da granulosa bovina. Portanto, PPARG é envolvido na regulação da esteroidogênese, crescimento folicular e ovulação em bovinos. O segundo estudo teve como objetivo investigar se a injeção intrafolicular com os três principais NEFAs (ácido oleico, esteárico e palmítico) afeta o desenvolvimento do folículo dominante e a expressão de RNAm de genes candidatos nas células da granulosa. Observou-se que a injeção intrafolicular com os NEFAs reduziram o crescimento folicular 24 e 48 h após o tratamento, demonstrando que altas concentrações dos NEFAs são prejudiciais para o desenvolvimento folicular. No entanto, a expressão de genes relacionados a esteroidogênese, metabolismo e apoptose não foram afetados. Da mesma forma, a expressão de RNAm do PPARG não foi alterada após o tratamento. Portanto, os NEFAs afetam a taxa de crescimento folicular do folículo dominante, mas o mecanismo de ação ainda necessita mais estudos. O terceiro estudo teve como objetivo avaliar os efeitos dos NEFAs e BHBA nas células endometriais bovinas. Os resultados obtidos revelaram que os tratamentos in vitro com NEFAs e NEFAs+BHBA induziram um acúmulo de lipídeos nas células, estimularam a produção de espécies reativas ao oxigênio (ROS), alteraram a morfologia das células e aumentaram a expressão de RNAm dos genes relacionados ao estresse oxidativo, apoptose e transporte de glicose. O estudo também evidenciou que o ácido palmítico (AP) afeta a regulação epigenética nas células endometriais, alterando a trimetilação da lisina 4 da histona 3 (H3K4me3) e a expressão de RNAm da DNA metiltransferase 1 (DNMT1). Em conjunto, os dados apresentados evidenciam os efeitos deletérios do aumento dos NEFAs e BHBA no desenvolvimento folicular e nas células endometriais bovinas.

ABSTRACT

Dairy cows milk production has increased over the past decades as a result of intense genetic selection. However, the advances in genetic selection of dairy herds did not come with an improvement of reproductive parameters. Negative energy balance (NEB) during postpartum period is important risk factor in the establishment of reproductive failure in high producing dairy cows. During NEB, nonesterified fatty acids (NEFAs) and -hydroxybutyrate (BHBA) levels are increased in the serum and follicular fluid and affect follicular microenvironment and endometrium in cattle. Furthermore, the exact NEFAs and BHBA mechanism of action is not yet established and may occur via nuclear receptors. Therefore, the aim of present study was to investigate NEFAs and BHBA action on folliculogenesis and endometrium, as well as to investigate if peroxisome proliferator activated receptor gamma (PPARG) is involved in their regulation in cattle. In the first study, the aim was to investigate if the PPARG participates in the regulation of dominant follicle development and ovulation. Findings from this study revealed that the relative mRNA abundance of PPARG was similar between dominant and subordinate follicles around follicle deviation, decreased after the LH surge, and increased before ovulation. Intrafollicular injection of Troglitazone (TGZ; a PPARG agonist) inhibited follicular growth and decreased CYP19A1 mRNA abundance in granulosa cells. These findings indicate that PPARG is involved in the regulation of steroidogenesis, follicle growth and ovulation in cattle. In a second study, the aim was to investigate if intrafolicular injection of three most important NEFAs (oleic, stearic and palmitic acids) affects dominant follicle development and mRNA expression of candidate genes in granulosa cells. NEFAs injection reduced follicular growth at 24 and 48 h, demonstrating that the high concentrations of NEFAs are detrimental to follicle development. The mRNA expression of genes related to steroidogenesis energetic metabolism and apoptosis examined were not affected by intrafollicular injection of NEFAs. However, NEFAs affected the follicle growth rate of dominant follicle but the mechanism of action still needs further study. In the final study, we evaluated the effects of NEFAs and BHBA in endometrium cells. Findings from this study showed that in vitro treatment with NEFAs and NEFAs plus BHBA increased lipid accumulation, stimulated reactive oxygen species (ROS), altered the morphology and the mRNA expression of genes related to oxidative stress, apoptosis and glucose transport in the endometrium cells. Also, palmitic acid (PA) was able to modulate the try-methylation of histone 3 lysine 4 (H3K4me3) and the mRNA expression of DNA methyltransferase 1 (DNMT1). Altogether, data present in these studies provided evidence that NEFAs and BHBA are detrimental to follicle development and endometrium cells in cattle.