Eventos fisiológicos e bioquímicos relacionados a capacitação espermática de garanhões em condições in vitro

RESUMO

Apenas dois potros foram nascidos de FIV (fertilização in vitro) convencional em equinos, ambos no início dos anos 90. O principal motivo do insucesso da técnica é direcionado ao espermatozoide do garanhão, que não é capaz de penetrar a zona pelúcida e fertilizar o oócito provavelmente devido a sua incompleta ativação (capacitação) em condições in vitro. Capacitação pode ser definida como o conjunto de mudanças físicas e biológicas que acontecem no espermatozoide o tornando apto a fertilizar o oócito em condições in vivo ou in vitro. Para que esse processo ocorra, o espermatozoide deve estar submetido a um ambiente que contenha bicarbonato (HCO3 - ), cálcio (Ca2+) e albumina. Essas substâncias causarão mudanças nas concentrações de adenosina monofosfato cíclico (AMPc), pH e Ca2+ intracelular, além alteração no potencial de membrana causando reorganização da membrana plasmática e depleção do colesterol, levando ao espermatozoide à reação acrossomal e fertilização do oócito. Infelizmente, nos equinos várias etapas da capacitação ainda não estão bem elucidadas. O objetivo desse trabalho foi demonstrar, por meio do uso de citometria de fluxo, microscopia de fluorescência, crio-eletromicroscopia e imunohistoquímica, algumas etapas da capacitação espermática de garanhões na presença de moléculas que podem estimular esse processo, além de compreender qual adenilato ciclase (solúvel ou transmembrana) está envolvida em algumas das etapas desse evento. O uso da probe Annexina-V em condições capacitantes demonstrou a ocorrência da exposição da fosfatidilserina (PS) em espermatozoides de garanhão durante o processo de capacitação, porém em uma pequena porcentagem da população (p0,05). Além disso, o uso de cafeína e dibutiril-AMPc indicam a relevância da via sAC/pkA para esse processo (p0,05). A observação de três diferentes padrões de fluorescência da Annexina-V no espermatozoide viável de garanhão sugere etapas sequenciais na remodelação da membrana plasmática. Em relação aos efeitos na fluidez de membrana e reação acrossomal induzida, diferentes concentrações de Ca2+ não interferiram na população espermática viva, merocianina e FITC-PNA 647 positiva (p0,05). O cálcio deve estar presente no meio capacitante uma vez que, na presença de seu quelante EGTA, essas etapas da capacitação foram bloqueadas. Porém o cálcio não deve estar obrigatoriamente presente em elevadas concentrações para iniciar a capacitação em espermatozoides de garanhão como é necessário em outras espécies. Diferentes concentrações de progesterona (P4) e albumina sérica bovina (BSA) também não foram capazes de aumentar a fluidez de membrana ou induzir reação acrossomal nos espermatozoides de garanhão (p0,05). Em relação as adenilato ciclases, a adenilato ciclase solúvel (sAC) no espermatozoide de garanhão demonstrou ser responsável pelo aumento da fluidez de membrana na presença de bicarbonato. Esse resultado foi demonstrado pelo uso do LRE1, um inibidor específico da sAC que demonstrou não causar efeitos colaterais em outros eventos fisiológicos espermáticos como alteração do potencial mitocondrial (p0,05). A imunohistoquímica da sAC em espermatozoide de garanhões demonstrou diferente localização comparada à sAC de suínos. No espermatozoide de garanhão essa enzima está presente formando uma linha pontilhada como um cordão na parte distal do acrosoma enquanto no suíno essa enzima está presente na parte apical da região acrossomal e na porção inicial da peça intermediária. A ação da forskolina indicou que a adenilato ciclase transmembrana (tmAC) possivelmente está presente no espermatozoide de garanhão e pode desempenhar um papel na reação acrossomal. Contudo, o fato da necessidade de uma alta concentração (500 µM) necessária para demonstrar seu efeito comparada a outras espécies indica que mais estudos como o uso de inibidores específicos (como o ddAdo) ou imunohistoquímica da tmAC (AC1-9) devem ser realizados no intuito de corroborar e validar os resultados encontrados. Em conclusão os resultados obtidos no presente trabalho elucidam diversos questionamentos na capacitação espermática de garanhões como exposição da PS, papel de diferentes concentrações Ca2+, P4 e BSA nesse evento além do papel de diferentes adenilato ciclases em alguns estágios da capacitação demonstrando que a capacitação é um processo complexo que varia entre as espécies.

ABSTRACT

Only two foals have ever been born from conventional equine IVF (in vitro fertilization), both in the early 1990s. The main reason for the conventional IVF failure is thought to be the stallion spermatozoa, which are not able to penetrate the zona pellucida, most likely due to incomplete activation (capacitation) under in vitro conditions. Capacitation is considered as a consecutive activation of different signaling pathways inducing physiological and biochemical modifications which primes the sperm for fertilization in vitro. To have the capacitation occur, the sperm must be under an environment (in vivo or in vitro) that contains bicarbonate (HCO3 - ), calcium (Ca2+) and albumin. These elements will besides changes in membrane potential, provide changes in cyclic adenosine monophosphate (cAMP) levels, intracellular pH and intracellular Ca2+ causing plasma membrane reorganization and cholesterol depletion leading the sperm to undergo the acrosome reaction and fertilize the oocyte. The aim of this work was to show by flow cytometry, fluorescence microscopy, cryo-electron microscopy and immunohistochemistry some capacitation steps in stallion spermatozoa in the presence of molecules that can trigger this process and also understand which molecules may be involve in some capacitation steps. The use of the probe Annexin-V in capacitating conditions showed a significant increase in the live, Annexin-V positive sperm population indicating a phosphatidylserine (PS) exposure in stallion sperm during this process (p0.05), but it was only in a small percentage of viable sperm. Stimulation of the sAC/cAMP/PKA pathway by caffeine and dibutyryl-cAMP indicated the relevance of this pathway for PS exposure. The observation of three different staining patterns for Annexin-V in live stallion sperm may warrant further investigation with respect to whether these represent sequential steps in membrane remodeling. Regarding the effects in membrane fluidity and induced acrosome reaction different concentrations of calcium did not interfere in the population live merocyanine and PNA-positive spermatozoa (p>0.05). Also, different concentrations of progesterone (P4) and bovine serum albumin (BSA) were not able to increase membrane fluidity or induced acrosome reaction (p0.05). However, calcium should be present in the medium since EGTA (ethylene glycol-bis (-aminoethyl ether)-N,N,N,N-tetraacetic acid; 2 mM) was able to block all this capacitation steps, but there is no need for higher concentrations (2 mM) to start capacitation in stallion sperm as is needed in other species. Regarding the adenilato cyclases (ACs), the presence of sAC (soluble) in the stallion sperm was shown to be responsible for the increase in membrane fluidity in the presence of bicarbonate. This finding was possible to demonstrate with the use of LRE1, a sAC specific inhibitor that showed no effect in other sperm physiological events (p>0.05). The immunostaining of sAC in stallion sperm indicated different localization compared to boar. In stallions, the enzyme was present as a dotted line (diadem-like pattern) distal from the acrosomal area, while in boars, the sAC was present in the acrosomal area and in the neck. The action of forskolin indicated that tmAC (transmembrane) may be present in the stallion sperm and may play a role in the acrosome reaction. However, the fact that a relatively high concentration (500 µM) was needed to show this effect compared to other reports, indicates that more studies like use of specific inhibitors of tmAC (as ddAdo) or immunostaining of the AC1 to 9 must be performed in stallion sperm to confirm the findings. In conclusion, the findings in this work elucidate several questions in stallion capacitation as PS exposure, role of different concentrations of calcium, progesterone and BSA in this process and the role of adenylyl cyclases in some stallion capacitation events showing that capacitation is a complex process that differs among species.