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Tese em Português | VETTESES | ID: vtt-221223

Resumo

Biofilmes multiespécies são ecossistemas microbianos complexos que podem ser fonte de contaminação entre ambientes industriais e alimentos. O estudo, teve como objetivos realizar a caracterização molecular e avaliar expressão de genes relacionados à formação de biofilme, bem como, a dinâmica de formação e arquitetura de biofilmes puros e mistos de Listeria monocytogenes e Salmonella Typhimurium. Os três isolados de L. monocytogenes foram submetidos a caracterização de genes relacionados a formação de biofilme (flaA, prfA, luxS, agrA, agrB, agrC, agrD), a resistência a biocidas (mdrT, mdrM, mdrL, idE), a adaptação ao pH e a concentrações de sal (SSI-1 lmo 0444, SSI-1 lmo 0445, SSI-1 lmo 0446). Um isolado de S. Typhimurium foi submetido a avaliação de genes envolvidos na produção de fímbrias, adesão, virulência, formação de celulose e biofilme (adrA, lpfA, agfA, sipA), a quorum sensing (sidA) e a resistência ao amônio quaternário (qacE1). A dinâmica de formação de biofilmes puros e mistos foi avaliada nos tempos de 1 h, 24 h, 96 h e 120 h em superfície de polipropileno a 12 °C e 37 °C. Os biofilmes maduros de L. monocytogenes na condição pura e associada com S. Typhimurium em superfície de polipropileno a 12 °C e 37 °C foram submetidos a expressão dos genes flaA, prfA, luxS e agrABCD. Os isolados de L. monocytogenes apresentaram os genes flaA, prfA, luxS, agrA, agrB, agrC, agrD, mdrT, mdrM, mdrL e idE, e S. Typhimurium carreava os genes adrA, lpfA, agfA, sipA, sidA. O crescimento planctônico e séssil de L. monocytogenes e S. Typhimurium foi relacionado a temperatura de incubação, obtendo-se contagens mais elevadas em 24 h a 37 °C, e em 96 h e 120 h a 12 °C. A adesão inicial de L. monocytogenes e S. Typhimurium foi afetada negativamente pela condição mista (p<0,001). Biofilmes puros de L. monocytogenes e S. Typhimurium apresentaram contagens mais elevadas em 96 h e 120 h quando comparados as populações individuais em biofilmes mistos. Contudo, não foi observado diferença estatística na contagem entre biofilmes puros de L. monocytogenes, puros de S. Typhimurium e a população total em biofilmes mistos (Listeria+Salmonella) a 12 °C. Em MEV, pode-se observar estrutura de aspecto viscoso promovendo a adesão (1 h) bacteriana em biofilmes mistos, e a partir de 24 h a presença de matriz exopolissacarídeos (EPS). Biofilmes puros e mistos foram capazes de manter células viáveis por 3000 h a 10 °C com contagens superiores a 120 h (p<0,05). Biofilmes maduros de L. monocytogenes não sofreram interferência da temperatura, superfície e condição mista com S. Typhimurium sobre a expressão dos genes prfA, luxS e agrBCD, contudo houve interferência na expressão de flaA e agrA. Desse modo, a caracterização da dinâmica de formação de biofilmes mistos, juntamente com presença e expressão de genes relacionados a formação de biofilme, demostrou a associação desses patógenos para a formação e manutenção de biofilmes mistos, e além disso, torna-se resultados importantes para a indústrias de alimentos e saúde pública.

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Multispecies biofilms are complex microbial ecosystems that can be a source of contamination between industrial environments and food. The study aimed to evaluate the molecular characterization and expression of genes related to biofilm formation and stressful conditions, and the dynamics of formation and architecture of pure and mixed biofilms of L. monocytogenes and S. Typhimurium. L. monocytogenes isolates were subjected to the characterization of genes related to biofilm formation (flaA, prfA, luxS), to stressful conditions (agrA, agrB, agrC, agrD), biocide resistance (mdrT, mdrM, mdrL, idE), adaptation to pH and salt concentrations (SSI-1 lmo 0444, SSI-1 lmo 0445, SSI-1 lmo 0446, LMOf2365_0481). S. Typhimurium was evaluated for genes linked to fimbriae production, adhesion, virulence, cellulose and biofilm formation (adrA, lpfA, agfA, sipA), quorum sensing (sidA) and resistance to quaternary ammonium (qacE1). The formation of pure and mixed biofilms was evaluated at 1h, 24h, 96h and 120h on the polypropylene surface at 12°C and 37°C. The mature biofilms of L. monocytogenes were subjected to the gene expression the flaA, prfA, luxS, and agrABCD. The isolates of L. monocytogenes presented the genes flaA, prfA, luxS, agrA, agrB, agrC, agrD, mdrT, mdrM, mdrL and idE, and S. Typhimurium demonstrated the genes adrA, lpfA, agfA, sipA, sidA. Planktonic and sessile growth was directly related to incubation temperature, obtaining higher counts in 24h at 37°C, and in 96h at 12°C. The initial adhesion of L. monocytogenes and S. Typhimurium was affected by the mixed condition (p<0.001). Pure biofilms from L. monocytogenes and S. Typhimurium showed higher counts in 96h and 120h when compared to individual populations in mixed biofilms. However, no statistical difference was observed between pure biofilms of L. monocytogenes, pure S. Typhimurium and the total population in mixed biofilms (Listeria+Salmonella), especially at 120h/12°C. It was observed that the dispersion of adhered cells directly affected the maintenance of planktonic cells, especially after 96h in both temperatures. In SEM, structure of the viscous aspect could be observed promoting bacterial adhesion (1h) in mixed biofilms, and after 24h with the presence of matrix exopolysaccharides (EPS). The pure and mixed biofilms were able to maintain viable cells for 3000h at 10°C with counts greater in 120h (p<0.05). Mature biofilms of L. monocytogenes were not affected by temperature, surface, and association with S. Typhimurium on the expression of prfA, luxS and agrBCD genes, interfering with the expression of flaA and agrA. Thus, the dynamics of the formation of mixed biofilms, linked to the presence and expression of genes related to the formation biofilms, are factors that prove the association of these pathogens for the formation and maintenance of mixed biofilms, it becomes important results for the food industries and the public health.

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