Análise da evolução do gene msp1 de Anaplasma marginale em bezerros e carrapatos e Propagação e caracterização de um isolado de Anaplasma marginale de Portugal em células IDE8

RESUMO

Este trabalho é composto de dois capítulos O primeiro capítulo visou a avaliação da diversidade das sequências repetidas da proteína MSP1a de A. marginale em bovinos experimentalmente infectados e em R. microplus durante o período de 1 ano e realizou-se o reisolamento da estirpe AmRio 1 de A. marginale a partir de leucócitos. O segundo capítulo objetivou o isolamento, propagação e caracterização de uma estirpe de A. marginale de Portugal em células IDE8. Para a avaliação da diversidade de A. marginale, os bovinos foram infestados com larvas de R. microplus e posteriormente as estirpes AmRio 1 e AmRio 2 mantidas em cultivo celular foram inoculadas respectivamente no bovino 1 e no bovino 2. Posteriormente amostras de sangue foram colhidas durante 1 ano para realização de esfregaços, hematócrito, proteínas plasmáticas e a realização de seminested PCR para os genes msp5 e msp1. A partir de amostras de sangue também foram realizados isolamentos de A. marginale a partir de leucócitos. Carrapatos foram colhidos durante todo o período de estudo e suas glândulas salivares, intestinos e saliva foram submetidos à seminested PCR para o gene msp5 e msp1. Ambos os animais apresentaram estabilidade dos parâmetros avaliados e ausência de sinais clínicos, revelando uma persistência da infecção. Inclusões foram observadas em leucócitos em um esfregaço do animal 1, e foi realizado reisolamento de A. marginale nas quatro tentativas utilizando-se leucócitos para o inóculo. O animal 1 se tornou positivo para o gene msp5 a partir do dia 12 após a infecção, enquanto o animal 2 não se tornou positivo para a cepa inoculada durante todo o período de estudo analisado. As repetições em tandem avaliadas revelaram positividade para a estirpe AmRio 1 no animal 1. De 58 amostras de órgãos de carrapatos, 6 foram positivas para o gene msp5 no animal 1. No animal 2, de 20 amostras analisadas, 4 foram positivas para o gene msp5. No segundo capítulo utilizou-se eritrócitos de um bovino naturalmente infectado da região do Alentejo, Portugal, para a realização do isolamento de uma estirpe de A. marginale em células IDE8. O animal doador do inóculo foi considerado persistentemente infectado com 0,25% de rickettsemia. Observou-se inclusões características da infecção trinta e cinco dias após a inoculação em células IDE8.

ABSTRACT

This thesis consists of two chapters The purpose of the first chapter was to evaluate the tandem repeat diversity in the major surface protein MSP1a of Anaplasma marginale in experimentally infected cattle and in Rhipicephalus microplus over the span of 1 year, and re-isolation of the A. marginale AmRio1 strain from cattle leukocytes was performed. The second chapter was aimed at isolating, propagating, and characterizing a novel Anaplasma sp. genotype from Portugal in IDE8 cells. To evaluate A. marginale genetic diversity, cattle were infested with R. microplus larvae and subsequently infected by A. marginale from tick cell cultures. The strains AmRio1 and AmRio2 were inoculated in bovine 1 and bovine 2, respectively. Subsequently, blood samples were collected over 1 year for blood smears, hematocrit, plasma proteins, and semi-nested polymerase chain reaction (PCR) for the msp5 and msp1 genes. A. marginale was also isolated from the cattle leukocytes. Ticks were collected and their salivary gland and gut DNA were tested using semi-nested PCR for the msp5 and msp1 genes. Both animals showed stability in the evaluated parameters and absence of clinical signs, showing that they had persistent infection. A blood smear from Animal 1 showed inclusions inside the leukocytes, and four attempts were made to isolate Anaplasma sp. from leukocytes for the inoculum. Animal 1 became positive for the msp5 gene on day 12 after infection, while positivity was detected in Animal 2 only 77 days after second exposure to the agent. The tandem repeats were stable when the blood and tick samples of both animals were evaluated, demonstrating the presence of the strains AmRio1 in Animal 1 and AmRio2 in Animal 2. In the second chapter, erythrocytes from a naturally infected bovine from Portugal were used for isolating Anaplasma sp. in IDE8 cells. Suggestive inclusions of infection were observed in the IDE8 cells 35 days after inoculation. The Anaplasmataceae family 16S rRNA gene from the cultures was sequenced, and showed that the isolated rickettsia was close to the A. platys species in the phylogenetic tree.