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Tese em Português | VETTESES | ID: vtt-221558

Resumo

A neurogênese em mamíferos adultos ocorre principalmente nas zonas subventricular e subgranular do encéfalo, mas também há relatos de sua ocorrência na medula espinhal. Ao cultivar o tecido proveniente de regiões neurogênicas, é possível obter células tronco neurais e neuroprogenitoras que são caracterizadas pelo seu potencial de gerar neurônios e neuroglia. Em um estudo realizado com ratos foi possível obter essas células através do cultivo primário de medula espinhal, mas não há estudos em cães, o que justifica o presente trabalho ao representar uma fonte fidedigna para estudos sobre neurogênese e terapias neuroregenerativas da medula espinhal nesta espécie. Em virtude disso, este estudo tem o objetivo de isolar, cultivar e caracterizar células tronco neurais/neuroprogenitoras provenientes da medula espinhal de fetos caninos em terço final de gestação. As células foram isoladas a partir de fragmentos da medula espinhal e foram cultivadas em meio de cultivo livre de soro e suplementado com os fatores de crescimento EGF, FGF-2 e associação de ambos. Essas células foram observadas diariamente por microscopia óptica para a análise das suas características morfológicas. A partir do terceiro dia de cultivo foi possível observar agrupamentos celulares translúcidos semelhantes às neuroesferas com aproximadamente 50 m chegando até 200 m com sete dias de cultivo. Ao comparar as neuroesferas tratadas com diferentes fatores de crescimento, foi possível constatar que o formato foi semelhante, porém o diâmetro e número de neuroesferas observadas no grupo FGF-2 foi menor. Todos os grupos expressaram os genes característicos das neuroesferas, como o SOX-2, importante marcador de células-tronco pluripotentes, a Nestina como marcador de células neurais progenitoras e o GFAP expresso principalmente por células gliais imaturas e astrócitos. No entanto, o grupo FGF-2 teve maior expressão do gene GFAP, enquanto o EGF teve maior expressão da Nestina sendo possível presumir que em neuroesferas provenientes da medula espinhal de cães o FGF-2 estimula a gliogênese. Além da expressão gênica, as células também foram marcadas fenotipicamente pelo método de imunofluorescência para as proteínas Nestina, GFAP e beta-Tubulina III caracterizando-as como neuroesferas e, por fim, concluindo que é possível isolar e cultivar células-tronco neurais e neuroprogenitoras a partir da medula espinhal de fetos caninos.

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Neurogenesis in adult mammals occurs mainly in the subventricular and subgranular areas of the brain, but there are also reports of its occurrence in the spinal cord. By culturing tissue from neurogenic regions, it is possible to obtain neural stem cells (NSC) and neural progenitor cells (NPC) that are characterized by their potential to generate neurons and neuroglia. In a study with rats, it was possible to obtain these cells by primary culture of spinal cord, but there are no studies in dogs, which justifies the present work by representing a reliable source for studies on neurogenesis and neuroregenerative spinal cord therapies in this species. Because of this, this study aims to isolate, cultivate and characterize NSCs and NPCs from the spinal cord of canine fetuses in the final third of gestation. Cells were isolated from spinal cord fragments and were cultured in a serum-free culture medium supplemented with EGF, FGF-2 growth factors and a combination of both. These cells were observed daily by optical microscopy for analysis of their morphological characteristics. After 3 days in culture, it was possible to observe translucent cell clusters similar to neurospheres with approximately 50 m, and after 7 days, they grew to a size of approximately 200 m. By comparing the neurospheres treated with the different growth factors, we found that their shape was similar but the diameter and number of clusters in the group treated with FGF-2 were smaller. All growth factor groups expressed the characteristic genes of neurospheres, like SOX-2, an important marker for pluripotent stem cells, Nestin, a marker for NPCs, and GFAP, which is mainly expressed by immature glial cells and astrocytes. However, the FGF-2 group showed a higher expression of GFAP, whereas the EGF group had a higher Nestin expression, being possible to presume that in neurospheres originated from canine spinal cord FGF-2 stimulates gliogenesis. Besides gene expression, the cells were also marked phenotypically by immunofluorescence for Nestin, GFAP, and Beta-tubulin III proteins, characterizing them as neurospheres and finally concluding that it is possible to isolate and cultivate neural stem cells and neural progenitor cells from the spinal cord of canine fetuses.

Biblioteca responsável: BR68.1