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Tese em Português | VETTESES | ID: vtt-221671

Resumo

As abelhas são muito importantes para o ser humano e para o meio ambiente, em 12 função do papel fundamental que desempenham, através da polinização. Entretanto, 13 vem sendo relatada, em todo o mundo, uma diminuição significativa de colônias da 14 espécie Apis mellifera, causada por diversos fatores, entre eles, infecções virais. Para 15 estudo e diagnóstico de enfermidades causadas por vírus utiliza-se o cultivo celular in 16 vitro. Atualmente, existem apenas duas linhagens celulares de Apis mellifera, 17 entretanto, essas linhagens não estão disponíveis comercialmente, além de serem 18 permanentemente infectadas pelo vírus deformador de asas, o que impossibilita seu 19 uso, especialmente em pesquisas relacionadas às interações célula-patógeno ou 20 entre patógenos. Com base nisso, descrevemos técnicas para obtenção de uma nova 21 linhagem celular de abelhas, através da descrição de cinco agentes de imortalização 22 celular, e padronização de técnicas para a elaboração e manutenção de cultivos 23 primários dessa espécie. Atualmente, as técnicas de imortalização celular utilizadas 24 em cultivos celulares de insetos são adaptadas daquelas utilizadas em células de 25 mamíferos. Cada técnica apresenta vantagens, limitações, praticidades e implicações 26 genotípicas e fenotípicas. A escolha da técnica de imortalização é uma etapa 27 fundamental e desafiadora no desenvolvimento de uma linhagem celular, visto que ela 28 deve, idealmente, possibilitar longos períodos de viabilidade celular, com elevado 29 número de passagens, além de manter o genótipo e fenótipo das células semelhante 30 ou idêntico ao tecido original. Para a elaboração dos cultivos primários, foram 31 avaliados os meios Grace, Leibovitz e Schneider, suplementados com soro fetal 32 bovino e antibióticos. Foram, também, avaliadas técnicas para manutenção e 33 criopreservação de cultivos celulares originados de ovos e larvas de abelhas Apis 34 mellifera. Para manutenção, foram avaliadas técnicas de tripsinização, uso de 35 espalhador celular e também de centrifugação do conteúdo celular. Com relação à 36 criopreservação, foram avaliadas duas diferentes soluções de congelamento: a 37 primeira, composta de 10% de DMSO e 90% de soro fetal bovino, e a segunda 38 composta por 30% de meio de cultivo, 10% de DMSO e 60% de soro fetal bovino. 39 Através das técnicas descritas, foram desenvolvidos 79 cultivos celulares, com até 19 40 passagens, e com viabilidade celular de até 140 dias. Dentre os meios avaliados, a 41 utilização do meio Grace na elaboração de cultivos primários apresentou maiores 42 taxas de proliferação celular e replicabilidade, demonstrando ser uma ótima opção 43 para a aplicação das técnicas de imortalização celular. O objetivo desta dissertação 44 foi padronizar técnicas para o desenvolvimento de cultivos primários, de fácil e prática 45 utilização, com o intuito de posterior imortalização celular, visando o desenvolvimento 1 de uma ou mais linhagens celulares da espécie Apis mellifera.

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Honeybees are particularly important for humans and the environment, due to the 11 fundamental role they play, through pollination. However, a significant decrease in 12 colonies of the species Apis mellifera has been reported worldwide, caused by several 13 factors, including viral infections. For the study and diagnosis of diseases caused by 14 viruses, in vitro cell culture is used. Currently, there are only two cell lines of Apis 15 mellifera, however, these lines are not commercially available, in addition these are 16 permanently infected by the wing-deforming virus, which makes their use difficult, 17 especially in research related to cell-pathogen interactions or between pathogens. 18 Based on this, we describe techniques for obtaining a new cell line of bees, through 19 the description of five agents of cell immortalization, and standardization of techniques 20 for the preparation and maintenance of honeybee primary crops. Currently, the cell 21 immortalization techniques used in insect cell cultures are adapted to those use in 22 mammalian cells. Each technique has advantages, limitations, practicalities, and 23 genotypic and phenotypic implications. The choice of the immortalization technique is 24 a fundamental and challenging step in the development of a cell line, since it should, 25 allow long periods of cell viability, with a high number of passages, in addition to 26 keeping the genotype and phenotype of the cells similar or identical to the original 27 tissue. For the preparation of primary crops, Grace, Leibovitz and Schneider media 28 were evaluated, with fetal bovine serum and antibiotics. Techniques for the 29 maintenance and cryopreservation of cell cultures originating from eggs and bee larvae 30 of Apis mellifera were also evaluated. For maintenance, trypsinization techniques, use 31 of cell spreader and centrifugation of cell contents were evaluated. Regarding 32 cryopreservation, two different freezing solutions were evaluated: the first, composed 33 of 10% DMSO and 90% fetal bovine serum; and the second composed of 30% of 34 culture medium, 10% of DMSO and 60% of fetal bovine serum. Through the described 35 techniques, 79 primary cell cultures were developed, with up to 19 passages, and with 36 cell viability of up to 140 days. Among the evaluated media, the use of Grace medium 37 in the elaboration of primary cultures showed higher rates of cell proliferation and 38 replicability, proving to be a great option for the application of cell immortalization 39 techniques. The objective of this dissertation was to standardize techniques for the 40 development of primary crops, easy and practical to use, with the aim of subsequent 41 cell immortalization, aiming at the development of one or more cell lines of the species 42 Apis mellifera.

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