OTIMIZAÇÃO DE MEIO DE DIFERENCIAÇÃO PARA ORGANOIDES PANCREÁTICOS CANINOS

RESUMO

A diabetes mellitus é uma doença metabólica crônica de causa multifatorial onde a produção da insulina e/ou sua ação podem estar prejudicadas. A ocorrência natural de condição clínica em cães semelhante a Diabetes mellitus tipo 1 (DMT1) humana impulsionou o uso desta espécie em estudos de novas possibilidades terapêuticas. A DMT1 tem como base a destruição das células que produzem insulina e, por essa razão, a terapia celular com organoides diferenciados em células semelhantes à poderiam representar, finalmente, a cura da doença. Organoides são estruturas tridimensionais derivadas de células-tronco embrionárias ou tecidoespecíficas com habilidade de auto-organização, diferenciação celular e morfogênese semelhante ao órgão correspondente. Fragmentos de tecido pancreático fresco de três cães submetidos à eutanásia na Faculdade de Veterinária de Utrecht, Holanda, foram isolados, cultivados em meio de expansão e transferidos para meios de diferenciação em dois experimentos com objetivo de otimizar o meio para produção de células semelhantes à produtoras de insulina. Os organoides foram caracterizados pela expressão gênica através de reação em cadeia mediada pela polimerase quantitativa (qPCR). Os resultados demonstraram a presença de células-tronco adultas com perfil gênico de células ductais em meio de expansão e potencial de diferenciação in vitro. Observou-se o aumento gradual da expressão dos marcadores Pdx1 e Nkx6.1 (precursores endócrinos) proporcional à duração do protocolo. Entretanto, marcadores de células endócrinas maduras não foram detectados. A adição de novos componentes, a duração dos estágios de diferenciação e o uso de sistema de suspensão de cultura de células são alternativas que podem ser testadas em futuras abordagens visando a obtenção de células produtoras de insulina que possam ser usadas na terapia celular.

ABSTRACT

Diabetes mellitus is a chronic metabolic disease of multifactorial cause where insulin production and/or its action may be impaired. The natural occurence of a clinical condition in dogs similar to human Type 1 diabetes mellitus (T1DM) has boosted its use as an experimental model in studies of new therapeutic possibilities. The destruction of beta cells that produce insulin is the basis of T1DM and, for this reason, cell therapy with organoids differentiated into stem cell beta-like cells could ultimately represent the cure of the disease. Organoids are threedimensional structures derived from embryonic stem cells or tissue-specific stem cell with ability to self-organization, cell differentiation and morphogenesis similar to the corresponding organ. Fragments of fresh pancreatic tissue from three dogs submitted to euthanasia at Veterinary School of Utrecht, The Netherlands, were isolated, cultivated in expansion medium and transferred to differentiation media in two experiments aiming the optimization of the medium for production of functional beta-like cells. Organoids were characterized by gene expression through quantitative chain reaction mediated by polymerase (qPCR). The results demonstrated the presence of adult stem cell with ductal cell profile in expansion medium and in vitro differentiation potential. A gradual increase in Pdx1 and Nkx6.1 (endocrine precursors) markers expression was noted, proportional to the duration of the protocol. However, endocrine mature cell markers were not detected. The addition of new components, the duration of differentiation stages and the use of a suspension cellular culture system are alternatives that can be tested in future approaches in order to obtain insulin-producing cells that can be used in cell therapy.