EFEITO IN VITRO DO COMPLEXO DE INCLUSÃO DE -CARIOFILENO EM -CICLODEXTRINA SOBRE Leishmania infantum E SEGURANÇA TOXICOLÓGICA EM ROEDORES

RESUMO

O tratamento da leishmaniose visceral (LV) com drogas sintéticas nem sempre é efetivo devido à alta toxicidade que apresenta. -cariofileno (BCP), um sesquiterpeno natural já demonstrou ter efeito anti-Leishmania spp. Trata-se de um óleo volátil e hidrofóbico, o que diminui a sua biodisponibilidade. A formação de complexos de inclusão com -ciclodextrina (-CD) é uma técnica que tem sido amplamente utilizada para aumentar a solubilidade aquosa de óleos vegetais e melhorar sua estabilidade. O objetivo deste trabalho foi desenvolver complexos de inclusão de BCP em -CD (BCP/-CD) e avaliar in silico a sua adsorção para testar sua atividade contra Leishmania infantum e avaliar a sua toxicidade, genotoxicidade e mutagenicidade em roedores. BCP/-CD foram preparados em razões molares de 12 (BCP -CD) por spray dryer. Os complexos formados foram caracterizados usando métodos físico-químicos apropriados. O ensaio in silico foi usado para prever a adsorção de BCP quando inserido em -CD. A atividade contra promastigotas foi testada in vitro usando resazurina (Alamar Blue®), a citotoxicidade foi determinada usando a linhagem de macrófagos J774. Os possíveis efeitos tóxicos in vivo foram avaliados por meio de toxicidade aguda e subcrônica e os efeitos genototóxicos e mutagênicos foram avaliados por meio dos testes de micronúcleo em reticulócitos e cometa alcalino. Os complexos BCP/-CD apresentaram forma de blocos, tamanho médio de 141,5 nm, índice de polidispersão de 0,255 e eficiência de encapsulamento de 19,2%. Os ensaios in silico previram uma ligação não covalante relativamente forte de BCP/-CD, com elevada capacidade de -CD para nanoencapsular BCP. BCP/-CD apresentou IC50 de 34,19 g/mL sobre promastigotas demontrando ser menos efetivo que BCP livre (IC50 de 7.65 g/mL), provavelmente por não ter liberado BCP da cavidade de -CD. -CD foi atóxica sobre macrófagos J774 podendo ser utilizado como carreador para BCP, que apresentou certa toxicidade para estas células (IC50 de 176.7 g/mL). Porém este efeito tóxico foi minimizado ao ser encapsulado em -CD, já que o complexo BCP/-CD apresentou IC50 de 249,1 g/mL. A DL50 de BCP/-CD foi superior a 5.000 mg/kg, sendo considerado não tóxico. A administração oral de 125 mg/kg de BCP/-CD durante 28 dias foi bem tolerada por ratos Wistar conforme evidenciado pela ausência de alterações importantes nos parâmetros hematológicos, bioquímica sérica e histopatologia. Não foram observados qualquer efeito genotóxico e mutagênico induzidos por BCP/-CD. Estes resultados indicam que a atividade de BCP/-CD sobre promastigotas não foi efetiva, porém para células J774 não houve toxicidade, podendo ser testado sobre amastigotas, visto que um dos principais entraves é a dificuldade de permitir que a nanopartícula internalize nos macrófagos para atingir o fagolisossomo e assim agir contra o parasito. BCP/-CD é seguro e não tóxico in vitro sobre macrófagos J774 e quando testados em animais de experimentação.

ABSTRACT

The treatment of visceral leishmaniasis (VL) with synthetic drugs is not always effective due to the high toxicity it presents. -caryophyllene (BCP), a natural sesquiterpene has already been shown to have an anti-Leishmania effect. However, it is volatile and hydrophobic oil, which decreases its bioavailability. The formation of inclusion complexes with -cyclodextrin (-CD) is a technique that has been widely used to increase the aqueous solubility of vegetable oils and improve their stability. The aim of this work was to develop complexes of inclusion of BCP in -CD (BCP/-CD) and to evaluate its adsorption in silico to test its activity against Leishmania infantum and to evaluate its toxicity, genotoxicity and mutagenicity in rodents. BCP/-CD were prepared in molar ratios of 12 (BCP-CD) by spray dryer. The complexes formed were characterized using appropriate physicochemical methods. The in silico test was used to predict the adsorption of BCP when inserted in -CD. The activity against promastigotes was tested in vitro using resazurin (Alamar Blue®), cytotoxicity was determined using the macrophage lineage J774. Possible toxic effects in vivo were assessed using acute and subchronic toxicity and the genototoxic and mutagenic effects were evaluated by means of micronucleus tests on reticulocytes and alkaline comet. The BCP/-CD complexes had a block shape, an average size of 141.5 nm, a polydispersity index of 0.255 and an encapsulation efficiency of 19.2%. In silico assays predicted a relatively strong non-covalent bond of BCP/-CD, with a high capacity of -CD for nanoencapsulate BCP. BCP/-CD showed an IC50 of 34.19 g/mL on promastigotes, demonstrating to be less effective than free BCP (IC50 of 7.65 g/mL), probably because the release of BCP from the -CD cavity did not occur. -CD was not toxic on J774 macrophages and can be used as a carrier for BCP, which presented a certain toxicity for these cells (IC50 176.7 g/mL). However its toxic effect was minimized when it was encapsulated in -CD, since the BCP/- CD complex had an IC50 of 249.1 g/mL. The LD50 of BCP/-CD was greater than 5,000 mg/kg, being considered non-toxic. Oral administration of 125 mg/kg BCP/-CD for 28 days was well tolerated by Wistar rats as evidenced by the absence of major changes in hematological parameters, serum biochemistry and histopathology. No genotoxic and mutagenic effects induced by BCP/-CD were observed. These results indicate that the activity of BCP/-CD on promastigotes was not effective, however for J774 cells there was no toxicity, and it can be tested on amastigotes, since one of the main obstacles is the difficulty of allowing the nanoparticle to internalize in the macrophages for reach the phagolysome and thus act against the parasite. BCP/-CD is safe and non-toxic in vitro on J774 macrophages and when tested on experimental animals.