ESTUDO IN VITRO DA RESPOSTA DE MACRÓFAGOS NA INFECÇÃO COM MICROSPORUM CANIS

RESUMO

Os dermatófitos são fungos importantes para a saúde pública, são transmitidos entre animais e seres humanos causando zoonoses. Microsporum canis é o principal agente das dermatofitoses em cães e gatos. A imunidade inata desempenha importante papel frente à infecção contra dermatófitos; entretanto, existem poucos estudos sobre a relação entre resposta imune inata e M. canis. Assim, o objetivo deste trabalho foi avaliar a capacidade fagocítica, microbicida e imunomoduladora de macrófagos desafiados com microconídios de M. canis. Macrófagos murinos, tratados ou não com LPS (1µg/ml), foram infectados com M. canis na proporção de 0,251 (microconídios/macrófagos) e cultivados por 30 min, 1 h, 3 h e 6 h. Após cada intervalo, as lamínulas foram coletadas e coradas por Giemsa, contando-se duzentas células e calculando-se a porcentagem de macrófagos que internalizaram pelo menos um microconídio. O sobrenadante foi coletado para medir os níveis de citocinas e óxido nítrico, e checou-se a viabilidade celular e o perfil dos macrófagos durante a infecção. A porcentagem de fagocitose aumentou no transcorrer do tempo, atingindo o máximo às 6 h. A porcentagem de macrófagos não estimulados com LPS que fagocitaram microconídios foi de 28,0%, 33,5%, 62,5% e 71,5%, respectivamente em 30 min, 1 h, 3 h e 6 h. Nos macrófagos estimulados com LPS esta porcentagem foi de 34,5%, 47,5%, 67,0% e 74,0%, respectivamente nos intervalos de 30 min, 1 h, 3 h e 6 h. A produção de óxido nítrico foi similar em ambos, macrófagos estimulados ou não com LPS. Níveis de TNF aumentaram no transcorrer do tempo em macrófagos desafiados com M. canis estimulados ou não com LPS, quando comparados com macrófagos não infectados (p<0,05). Níveis superiores de IL-6 foram produzidos por macrófagos estimulados com LPS e infectados com M. canis no intervalo de 1 h (p<0,05). A viabilidade celular diminuiu com o tempo, com o pico de morte dos macrófagos às 6 h. O teste de microbicidade mostrou que, mesmo após a fagocitose, os microconídios de M. canis permaneciam viáveis dentro dos macrófagos. Os macrófagos mostraram um perfil M2, o qual produz uma tendência de resposta anti-inflamatória que favorece o crescimento fúngico. Macrófagos apresentaram alta atividade fagocítica frente o M. canis, a qual aumentou quando previamente estimulados com LPS. Estímulo com LPS também aumentou a produção de citocinas, sugerindo uma modulação na resposta à infecção. O aumento na produção das citocinas pró-inflamatórias TNF- e IL-6 que são importantes no recrutamento de novas células fagocíticas e na resolução da infecção, foi observado nos macrófagos desafiados com M. canis. Os resultados sugerem que, apesar dos macrófagos apresentarem atividade fagocítica e produção de citocinas quando desafiados com M. canis, sua viabilidade e a atividade microbicida são prejudicadas, não sendo capazes de controlar a infecção.

ABSTRACT

Dermatophytes are important fungi for public health, as they are transmitted between animals and humans causing zoonoses. Microsporum canis is the main agent of dermatophytosis in dogs and cats. Innate immunity plays an important role in the establishment of dermatophytic infection; however, there are few studies on the relationship between innate immune response and M. canis. Thus, the aim of this work was to evaluate the phagocytic, microbicidal and immunomodulatory capacity of macrophages challenged with M. canis microconidia. Murine macrophages, treated or not with LPS (1µg /ml), were infected with M. canis in a ratio of 0.251 (microconidia/macrophages) and incubated for 30 min, 1 h, 3 h, and 6 h. After each interval, the coverslips were collected and stained by Giemsa, counting two hundred cells and calculating the percentage of macrophages that internalized at least one microconidium. The supernatant was collected to measure cytokine and nitric oxide levels, and cell viability and macrophage profile during infection were checked. The percentage of phagocytosis increased over time, peaking at 6 h. The percentage of non-stimulated LPS macrophages that phagocytosed microconidia was 28.0%, 33.5%, 62.5%, and 71.5%, respectively at 30 min, 1 h, 3 h, and 6 h. In LPS-stimulated macrophages, these percentages were 34.5%, 47.5%, 67.0%, and 74.0%, respectively at 30 min, 1 h, 3 h, and 6 h intervals. Nitric oxide production was similar in both macrophages stimulated or not with LPS. TNF- levels increased over time in macrophages challenged with M. canis stimulated or not with LPS when compared to uninfected macrophages (p <0.05). Higher levels of IL-6 were produced by LPS-stimulated and M. canis-infected macrophages within 1 h (p <0.05). Cell viability decreased over time with macrophages death peak at 6 h. Microbicity test showed that even after phagocytosis, M. canis microconidia remained viable within the macrophages. Macrophages showed an M2 profile, which produces a tendency of anti-inflammatory response that favors fungal growth. Macrophages showed high phagocytic activity against M. canis, which increased when previously stimulated with LPS. LPS stimulation also increased cytokine production, suggesting a modulation in the response to infection. Increased production of pro-inflammatory cytokines TNF- and IL-6, which are important in recruiting new phagocytic cells and resolving the infection, was observed in macrophages challenged with M. canis. The results suggest that, although macrophages present phagocytic activity and cytokine production when challenged with M. canis, their viability and microbicidal activity are impaired and unable to control infection.