ADIÇÃO DE COLESTEROL LIGADO À CICLODEXTRINA NO PROCESSAMENTO DE ESPERMATOZOIDES EQUINOS CRIOPRESERVADOS E ADIÇÃO DE ESTIMULANTES DA MOTILIDADE NO PÓS DESCONGELAMENTO

RESUMO

Este estudo propôs avaliar o efeito da adição de colesterol ligado à ciclodextrina (CLC) antes do processo de criopreservação e estimulantes de motilidade após o descongelamento (Fert Talp - FT e Pentoxifilina - PTX), sobre a cinética espermática (MT, MP, RAP, VCL, VSL, VAP e LIN), integridade de membrana plasmática, produção de peróxido de hidrogênio intracelular, potencial mitocondrial, desestabilização da membrana plasmática e fertilidade in vivo. Foram criopreservados dois ejaculados de 12 garanhões e cada ejaculado foi subdividido em quatro grupos G1 (sem CLC), G2 (1mg de CLC), G3 (1,5mg de CLC) e G4 (2mg de CLC). No experimento I o objetivo foi comparar os parâmetros espermáticos após a inclusão de CLC (G1-G4) e avaliar a longevidade celular pelo teste de Termorresitência - TTR após o descongelamento imediatamente (T0), 40 minutos (T40), 80 minutos (T80) e 120 minutos (T120). Além disso, objetivou-se avaliar o potencial mitocondrial e a desestabilização da membrana. No experimento II o objetivo foi comparar os parâmetros espermáticos nos grupos anteriores (G1-G4), com e sem adição do estimulante FT (20% - v/v) após o descongelamento, quanto a longevidade celular (TTR - T0, T40, T80 e T120 minutos) e avaliar a produção de peróxido de hidrogênio intracelular. No experimento III o objetivo foi comparar os parâmetros espermáticos nos grupos anteriores (G1-G4), com e sem adição do estimulante PTX (20% - v/v) após o descongelamento, avaliar a longevidade celular (TTR - T0, T40, T80 e T120 minutos), avaliar a produção de peróxido de hidrogênio intracelular, o potencial mitocondrial e a desestabilização da membrana. Além disso, objetivou-se avaliar a fertilidade do sêmen criopreservado em três grupos 1) Grupo controle (sem CLC); 2) Grupo 1,5mg de CLC; e 3) Grupo 1,5 mg de CLC + PTX. No experimento I, os grupos G3 e G4 apresentaram valores superiores de VCL, VSL e VAP. No T0 os parâmetros de MT e MP foram superiores no G3. Quanto ao potencial mitocondrial e a desestabilização da membrana não foram observadas diferenças significativas entre os grupos (p<0,05). No experimento II, a adição de FT foi benéfica à velocidade espermática (VCL, VSL e VAP) em alguns grupos experimentais e em tempos diferentes. O G2 com FT demonstrou maior percentual de células com membrana plasmática íntegra e sem peróxido de hidrogênio em comparação aos grupos sem adição do estimulante. No experimento III, a adição de PTX não foi benéfica aos parâmetros de cinética após o descongelamento ao decorrer do tempo em alguns grupos experimentais. No grupo G1 com PTX notou-se superioridade de células com membrana lesionada com peróxido de hidrogênio em comparação ao G4 com PTX e uma maior população celular com membranas íntegras sem peróxido de hidrogênio no grupo G4 com PTX em comparação ao G2 com PTX. A taxa de concepção nos grupos G1, G2 e G3 foram 50%, 66,7% e 66,7%, respectivamente. A adição de CLC melhorou os parâmetros cinéticos in vitro, sendo que as concentrações de 1,5 mg e 2 mg conferiram melhor resistência ao processo de criopreservação. A adição de FT conferiu longevidade e superioridade aos parâmetros de velocidade espermática. Em contrapartida, a adição do estimulante PTX, afetou a longevidade celular, demonstrando efeito prejudicial ao movimento espermático. Além disso, a inclusão de CLC não demostrou prejudicar a taxa de concepção em inseminações realizadas após a ovulação. Mediante os resultados encontrados no atual trabalho, pode-se concluir que as concentrações de CLC que melhor conferiram resistência aos espermatozoides ao processo de criopreservação com consequente incremento cinético às células espermáticas foram 1,5 mg e 2 mg. Os achados com a adição do estimulante FT, considerando-o estimulante de motilidade através do aumento no metabolismo celular, conferiu longevidade e superioridade aos parâmetros de velocidade espermática, sendo essa uma atribuição satisfatória além de conferir também maiores populações celulares com membrana plasmática íntegra sem a produção de peróxido de hidrogênio. Em contrapartida a adição do estimulante PTX, afetou a longevidade celular, demonstrando efeito prejudicial ao movimento espermático. E quanto a fertilidade do sêmen criopreservado, os resultados encontrados com a utilização de colesterol ligado a ciclodextrina não interferiu na fertilidade. Dessa forma, o colesterol ligado à ciclodextrina é benéfico à célula espermática ao processo de criopreservação, entretanto a adição de estimulante causou efeitos divergentes, aumentando os parâmetros e a longevidade celular (FT) ou diminuindo os parâmetros de cinética com o tempo (PTX).

ABSTRACT

The current study proposed to evaluate the effect of the addition of cholesterol bound to cyclodextrin (CLC) before the cryopreservation process and motility stimulants post thawed (fert talp FT and pentoxifylline PTX) on the spermatic kinetics (MT, MP, RAP, VCL, VSL, VAP and LIN), membrane integrity, production of intracellular hydrogen peroxide, mitochondrial potential, destabilization of the plasma membrane and in vivo fertility. Two ejaculates of 12 stallions were cryopreserved; subdivided into four experimental groups G1 (no CLC); G2 (1 mg of CLC), G3 (1.5 mg of CLC) and G4 (2 mg of CLC). In experiment I, the objective was to compare spermatic parameters after the inclusion of CLC (G1-G4), to evaluate cell longevity through the thermoresistance test - TTR post thawed immediately (T0), 40 minutes (T40), 80 minutes (T80) and 120 minutes (T120). In addition, mitochondrial potential and membrane destabilization were evaluated. In experiment II the objective was to compare spermatic parameters after the inclusion of CLC (G1-G4) and the addition of the stimulant FT, to evaluate cell longevity (TTR) post thawed (T0, T40, T80 and T120) and to evaluate the production of intracellular hydrogen peroxide. In experiment II the objective was to compare spermatic parameters in the groups (G1-G4), with and without the addition of the stimulant FT (20% - v/v) post thawed, as to the cellular longevity (TTR T0, T40, T80 and T120 minutes) and to evaluate the production of intracellular hydrogen peroxide. In experiment III the objective was to compare spermatic parameters in the groups (G1-G4), with and without the addition of the stimulant PTX (20% - v/v) post thawed, to evaluate cellular longevity (TTR - T0, T40, T80 and T120 minutes), to evaluate the production of intracellular hydrogen peroxide, the mitochondrial potential and the membrane destabilization. In addition, to evaluate the fertility of the cryopreserved semen in three groups 1) Control group no cholesterol addition; 2) Group cholesterol 1.5 mg, and 3) Group cholesterol 1.5 mg + PTX. In experiment I, groups G3 and G4 presented superior values of VCL, VSL and VAP. In T0, the parameters of MT and MP were superior in G3. As to mitochondrial potential and membrane destabilization, no meaningful differences were observed between the groups (p<0.05). In experiment II, the addition of FT was beneficial to spermatic speed (VCL, VSL and VAP) in some experimental groups and in different times. G2 with FT has demonstrated higher percentage of cells with intact membrane and without hydrogen peroxide in comparison to groups without the addition of the stimulant. In experiment III, the addition of PTX was not beneficial to the kinetics parameters post thawed along time in some experimental groups. In the group G1 with PTX it was observed superiority in cells with injured membrane and with hydrogen peroxide in comparison to G4 with PTX and a higher cell population with intact membranes and without hydrogen peroxide in the group G4 with PTX in comparison to G2 with PTX. The conception rate in the groups G1, G2 and G3 was, respectively, 50%, 66.7% and 66.7%. In this way, it is possible to conclude that the addition of the cholesterol bounded to cyclodextrin is beneficial to the spermatic cell in the cryopreservation process, however, the addition of stimulants post thawed has caused divergent effect. The stimulant FT has provided longevity and superiority to the spermatic velocity parameters. In contrast, the addition of the stimulant PTX has compromised the cellular longevity. In addition, the inclusion of CLC has not affected the conception rate in inseminations carried out after the ovulation.