Reprogramação celular in vitro à pluripotência (geração de células iPSCs) no modelo suíno a partir da metodologia não transgênica e não invasiva

RESUMO

O suíno é um interessante modelo biomédico por apresentar similaridades imunológicas, anatômicas e fisiológicas com o humano, e, portanto, a reprogramação de células à pluripotência neste modelo é vantajosa para o desenvolvimento de estudos translacionais. A utilização de células de pluripotência induzida (iPSCs) derivadas de células coletadas de forma não invasiva ou menos invasiva pode ser promissora em diversas terapias regenerativas devido à facilidade de obtenção, apesar de ainda não reportada nos animais domésticos. Por essa razão, este estudo tem como objetivos produzir células iPSCs suínas in vitro a partir de células derivadas de urina (urine derived cells ou UDCs) e a partir células mononucleares do sangue periférico (peripheral blood mononuclear cells ou PBMCs), provindas de coleta não invasiva e menos invasiva, respectivamente. Para tal, a urina e o sangue periférico foram coletados de três fêmeas suínas. A partir do sangue coletado foi realizada a separação por gradiente de densidade e a expansão de eritroblastos, entretanto, não foi obtido o número de células necessário para a reprogramação. A partir de amostras de urina processadas, células em cultivo in vitro foram observadas após aproximadamente uma semana. Uma das linhagens isoladas (UDC3) foi submetida ao processo de reprogramação a partir de metodologia integrativa, através de transdução lentiviral com os fatores de transcrição OCT4, SOX2, KLF4 e C-MYC (OSKM, humano ou murino), ou não integrativa, utilizando vetor epissomal, contendo os fatores C-MYC, LIN28, SOX2, KLF4, OCT3/4 e shp53. Foram obtidas apenas colônias reprogramadas derivadas da reprogramação integrativa, das quais isolamos três linhagens de iPSCs clonais (C1, C2 e C3) que se mantiveram em cultivo por pelo menos 28 passagens, demonstrando a capacidade de autorrenovação in vitro. As linhagens foram caracterizadas quanto à detecção de proteínas relacionadas à pluripotência por meio de imunofluorescência, quanto à quantificação de transcritos endógenos e exógenos, e à capacidade de diferenciação em corpos embrioides. Neste estudo foram geradas células suínas reprogramadas a partir de células de urina, o que possibilitará o desenvolvimento de novas tecnologias aplicadas ao modelo suíno beneficiando tanto a produção animal, quanto a ciência básica e translacional, visando sua utilização como modelo biomédico in vivo.

ABSTRACT

The swine is an attractive biomedical model because it shares immunological, anatomical, and physiological similarities with the human. It is advantageous to reprogram cells into pluripotency in this model to develop translational studies in human and veterinary regenerative medicine. In addition, iPSCs derived from cells collected in a non-invasive or less invasive methodology could have their use simplified, and is unprecedented in this animal model. Hence, this study aims to produce swine iPSCs cells in vitro from cells derived from urine (urine-derived cells or UDCs) and peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) in non-invasive or less invasive collection, respectively. Therefore, three swine females had their urine and peripheral blood collected. The collected blood was processed by density gradient separation, and erythroblast expansion was performed; however, the number of cells necessary for reprogramming was not obtained in our conditions. From the processed urine, we observed UDC cells after approximately one week in culture. One of the isolated lineages (UDC3) was subjected to the reprogramming processes, either using an integrative methodology through lentiviral transduction with the transcription factors OCT4, SOX2, KLF4, and C-MYC (OSKM, human or murine) or using a non-integrative methodology with episomal vectors containing the C-MYC, LIN28, SOX2, KLF4, OCT3 / 4 and shp53 factors. However, only colonies derived from integrative reprogramming were obtained, from which three clonal lineages (C1, C2, and C3) were isolated and maintained in culture for at least 28 passages, demonstrating the ability of self-renewal in vitro. The lineages were characterized for their morphology, the detection of proteins related to pluripotency by immunofluorescence, the quantification of endogenous and exogenous transcripts, and the ability to form embryoid bodies. The swine in vitro reprogrammed cells obtained in this study were obtained from UDCs and characterized. They may enable the future development of new technologies applied using the swine model, benefiting both animal production and translational science, aiming its use as a biomedical model in vivo.