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Clonagem e expressão de fragmentos funcionais(scFv) de anticorpo contra o Parvovírus canino-2 com a técnica da Phage display

Batista, Thiago Neves.
Botucatu; s.n; 02/02/2008. 60 p.
Tese em Português | VETTESES | ID: vtt-4401

Resumo

A parvovirose canina, uma das principais doenças infecto-contagiosas que acomete cães, é causada pelo Parvovírus canino-2 (CPV-2). Desde sua '" escrição importantes mutações ocorreram originando três tipos: CPV-2a e 2b, comumente detectados no Brasil, e o CPV-2c. Essas alterações antígênicas caracterizam o CPV como um dos principais modelos de evolução viral, sendo etectáveis com painéis de anticorpos monoclonais em técnicas simples como hemaglutinação e neutralização in vitro. A tecnologia de apresentação de :J oteínas em bacteriófagos (Phage display) tem diversas aplicações, dentre elas a apresentação de fragmentos recombinantes de anticorpos funcionais scFv), que podem ser produzidos em grande quantidade. Este trabalho utilizou Phage Display para expressar fragmentos scFv contra o CPV-2 , com uma etodologia descrita (Krebber, 1997). Após o cultivo e purificação do vírus, camundongos da linhagem High seleção IV A foram imunizados com o CPV-2 , sendo em seguida extraído RNA total do baço. A amplificação das cadeias leve e pesada, e sua ligação por SOE-PCR, permitiu a clonagem do scFv no fagomídeo pAK 100. Após a transformação da E.coli XL-1 blue, bacteriófagos 13 foram expressos apresentando o fragmento scFv. Três processos de seleção foram realizados, e após '0 Phage-ELlSA, um grupo de fagos foi selecionado. A partir deste um screening foi realizado por PCR sendo dois lones detectados. Após nova expressão de ambos uma nova reação de Phage-ELlSA foi realizada e demonstrou a especificidade destes clones com o CPV-2. Até o presente momento esta é a primeira descrição da técnica de Phage display apresentando fragmentos de anticorpo anti-CPV-2
Canine parvoviral disease, one of the most common infectious disorders of dogs, is caused by canine parvovirus (CPV-2). Several mutations have accurred since it was described in the late 1970s, originating three antigenic pes: CPV-2a and 2b, most commonly found in Brazil, and the CPV-2c. These tigenic differences characterize CPV-2 as an important model of virus evolution, and could be detected by monoclonal antibody panel in hemmaglutination and in vitro neutralization. Phage display has many a plications and have been used displaying functional antibodies fragments scFv) , which can be produced in large amount. The technology described here :: the expression of antibody recombinant fragments - scFv - against CPV-2, the methodology previously described (Krebber, 1997). After cultivation and purification of virus, High IV A mice were immunized with CPV-2, total RNA s extracted from spleen cells. Light and heavy chains were amplified, and en linked by SOE-PC R; and the product was cloned into a phagemid (pAK ). After the transformation on E. coli XL-1 blue, M13 bacteriophages were - ressed presenting the scFv fragment. Series of 3 rounds of panning was ied out, and after a Phage-ELlSA a group of phage was selected. A PCR - eening was conducted and two clones detected. After new expression a age-ELlSA was performed and demonstrated the specificity of these clones against the CPV-2. Until the moment this is the first description of the use of the :J age display, producing antibody fragments against CPV-2. -
Biblioteca responsável: BR68.1