Desenvolvimento e padronização de ELISA indireto para diagnóstico de Maedi/Visna virus em ovinos

RESUMO

A Maedi-Visna (MV) pode ser diagnosticada por várias formas, como Imunodifusão em gel de agarose (IDGA), Western blot, Ensaio imunoenzimático (ELISA), Radioimunoensaio,Reação em cadeia de polimerase (PCR), O IDGA é o método recomendado pela Organização Internacional de Epizootias (OIE), porém o ELISA é o método de escolha para grande número de amostras, embora seu custo elevado, tenha dificultado a rotina diagnóstica da MV em ovinos. Por isso, pesquisas são realizadas para conseguir padronizar e comercializar um ELISA brasileiro a fim de facilitar seu uso na rotina diagnóstica. O objetivo desta pesquisa foi desenvolver e padronizar um ELISA indireto para diagnóstico da MV. O antígeno foi obtido a partir de sobrenadante de cultivo celular de membrana sinovial caprina (MSC) inoculado com o Maedi Visna Vírus (MVV) cepa K1514, submetido a três ciclos de congelamento e descongelamento, e clarificação por centrifugação a 3000 g por 40 min. A suspensão clarificada foi precipitada por polietilenoglicol 8000 (PEG), em seguida foi centrifugada a 12000 g por 60 min, o pellet foi ressuspendido em Tampão Tris-HCl (TNE) e ultracentrifugado a 42000 g por 105 min em colchão de sacarose. O pellet foi ressuspendido em PBS contendo phenylmethylsulphonyl fluoride (PMSF). O ELISA foi realizado em microplacas de 96 poços, com incubação de uma hora a 37 ºC e lavagens em cada etapa, o revelador foi o-phenylenediamine (OPD) por 15 min ao abrigo da luz. Para a comparação entre os testes de ELISA e IDGA foram utilizadas 175 amostras de soros. A concentração ótima do antígeno foi 2 mg/mL e a melhor diluição do soro foi 1100. O ELISA detectou um maior número de positivos (41) que o IDGA (11), apresentando uma sensibilidade de 91%, especificidade de 82%. O ELISA apresentou uma sensibilidade melhor que o IDGA, porém a especificidade ficou abaixo do esperado, o que não inviabilizou seu uso como teste de diagnóstico do MVV