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Tese em Português | VETTESES | ID: vtt-7002

Resumo

A erliquiose canina é uma doença de prevalência mundial, causada por um microrganismo intracelular obrigatório, a Ehrlichia canis, que infecta células mononucleares, causando doença grave. O presente trabalho teve como objetivo a elaboração do cultivo de monócitos caninos para o isolamento, identificação e criopreservação de E. canis. As células mononucleares de amostras sangue periférico canino heparinizado, foram separadas pelo uso de gradiente de densidade Ficoll Hypaque d=1077 e após ajustar a concentração para 1x106 monócitos viáveis/mL, foram colocadas em suspensão em meio RPMI 1640 enriquecido de 2mM de L-glutamina e 10% de soro bovino fetal e distribuídos em placas de 24 alvéolos e incubados a 37°C em estufa umidificada e tensão constante de 5% de CO2. Os cães infectados por E. canis foram identificados por meio de pesquisa de mórulas em esfregaços sangüíneos e confirmados pela reação em cadeia da polimerase (PCR). Amostras de sangue de animais infectados foram submetidos ao mesmo protocolo acima descrito para isolamento das células mononucleares e utilizados para infectar culturas de monócitos de cães sadios para isolamento e propagação de E. canis. O período de acompanhamento foi de 30 dias. O tempo de aparecimento das primeiras formas erliquiais variou de dois a 10 dias, havendo propagação com a continuidade da incubação, porém de maneira discreta e variada. A remoção dos monócitos das placas de cultura foi realizada com uso de Lidocaína 0,5%. A criopreservação de monócitos infectados por E. canis foi realizado em freezer ?80°C e nitrogênio líquido, após acrescentar DMSO a 10% em soro bovino fetal. A propagação da E. canis é dependente da dose do parasita inoculada na cultura de monócitos caninos. O emprego de Lidocaína 0,5% é um método eficiente para a remoção e manutenção da viabilidade das células aderentes em placas de culturas de monócitos caninos. A viabilidade das culturas de monócitos infectados com E. canis é mantida após o congelamento em freezer -80°C ou em nitrogênio líquido. A cultura primária de monócitos caninos para isolamento e propagação de E. canis é laboriosa, com dificuldades na separação de células mononucleares e manutenção em cultura, por se tratarem de células com durabilidade limitada

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