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Tese em Português | VETTESES | ID: vtt-8134

Resumo

O objetivo do presente estudo foi determinar os efeitos da adição de hormônio do crescimento eqüino (eGH), fator de crescimento semelhante a insulina-I (IGF-I) e associação de ambos na maturação in vitro de oócitos eqüinos. Além de analisar a integridade estrutural de oócitos maturados e vitrificados em presença de copolímero PVA. Complexos cumulus oophorus compactos (COC) foram cultivados em TCM199 suplementado com 0,1% BSA e antibióticos. COCs (n=122) foram divididos em quatro tratamentos: 1) Controle, sem adição de hormônios (n=34); 2) 400ng/ml eGH (n=31); 3) 200ng/ml IGF-I (n= 35) e 4) 400ng/ml eGH + 200ng/ml IGF-I (n=22). Após a maturação de 30h, os oócitos foram fixados (n=37) ou submetidos a vitrificação (n=85). Os oócitos criopreservados foram expostos a 1,4 M dimetilsulfóxido (DMSO), 1,8 M etilenoglicol (EG) e 1% copolímero PVA (20% vinil acetato e 80% vinil álcool) por 3 min, transferidos para TCM com 2,8 M DMSO + 3,6 M EG + 0,6 M sacarose + 1% copolímero PVA por 1 min e envasados em palhetas abertas estendidas (OPS). As palhetas foram submetidas ao vapor de nitrogênio por 3 segundos e imersas em nitrogênio líquido. Para o descongelamento, os oócitos foram transferidos para PBS com concentrações decrescentes de sacarose: 0,5M, 0,25M, 0,125M e PBS com 0,4% BSA; permanecendo 5 minutos em cada solução. A avaliação da maturação nuclear e citoplasmática foi realizada por microscopia confocal a laser. Os índices de maturação oocitária foram 26,1% grupo controle, 23,5% eGH, 31,8% IGF-I e 17,6% eGH + IGF-I, não sendo detectada diferença entre os grupos (p>0,05). Contudo o índice de retomada da meiose (MI+MII) no grupo com associação dos hormônios foi de 86,7%, sugerindo que a utilização de eGH e IGF-I poderia incrementar esse índice. Não foram observadas alterações morfológicas nos oócitos vitrificados/descongelados. Pode-se concluir, que não houve diferença no índice de maturação nuclear e citoplasmático com a adição de eGH, IGF-I e associação de ambos. A vitrificação com utilização de copolímeros PVA mostrou-se viável para a criopreservação de oócitos da espécie eqüina, os quais permaneceram com membrana plasmática íntegra, não ocorrendo vacuolização e degeneração celular. Este é o primeiro trabalho que descreve a utilização de copolímeros PVA na vitrificação de oócitos eqüinos

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The objective of this study was to investigate the effects of equine growth hormone (eGH) and its relationship with insulin-like growth factor-1 (IGF-1) on the in vitro maturation (IVM) and development of equine oocytes. Additionally, we also evaluated the morphological and structural integrity of all equine oocytes subjected to IVM and cryopreservation. Complex cumulus oocytes (COCs) were cultured in TCM199 supplemented with 0.1% BSA and antibiotics. COCs (n=122) were placed in a four-well dish supplemented according to four treatments, as follows: a) control, no additives (n=34); b) 400 ng/mL of eGH (n=31); c) 200 ng/mL of IGF-1 (n=35); and d) 400 ng/mL of eGH + 200 ng/mL of IGF-1 (n=22). After maturation, oocytes were fixed (n=37) or subjected to the vitrification protocol (n=85). Cryopreserved oocytes were exposed to 1,4 M dimethyl sulfoxide (DMSO) + 1,8 M ethylene glycol (EG) + 1% PVA copolymer (20%vinyl acetate and 80% vinyl alcohol) for 3 min, and then transfer to 2,8 M DMSO + 3,6 M EG + 0,6 M sucrose + 1% PVA copolymer for 30 sec. Next, the oocytes were loaded to the open pulled straw and transferred to liquid nitrogen vapor, then held in vapor for 3 sec before being plunged into liquid nitrogen. After cryopreservation, the oocytes were thawed and transferred into a PBS containing a decreasing sucrose concentration, for 5 min of each concentration: 0.5M, 0.25M, 0.125M and PBS with 0.4% BSA. Nuclear and cytoplasmic maturation status were assessed by laser scanning confocal microscopy. Maturation rates of oocytes were 26.1% control, 23.5% eGH, 31.8% IGF-I and 17.6% eGH + IGF-I, werent significant difference among the treatment groups (p>0,05). However, the results suggest that the eGH + IGF-1 group can develop the assessment resumption of meiosis (MI+MII=86,7%). There werent morphological abnormalities after vitrification/thawing. In conclusion, the addition of eGH and/or IGF-I to our IVM protocol didnt increase rates of nuclear and cytoplasmic maturation. Oocytes subject to vitrification with copolymer PVA had an intact plasma membrane and didnt show any sign of vacuolization or degeneration. This is the first report showing the vitrification with PVA in equine oocytes

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