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Uso de espermatozóides bovinos como vetores de DNA exógeno na produção in vitro de embriões transgênicos

Simoes, Renata.
Tese em Português | VETTESES | ID: vtt-8700

Resumo

O animal é reconhecido como uma importante ferramenta para pesquisas biomédicas e biológicas, assim como para desenvolvimento farmacêutico e toxicológico. A tecnologia de transferência de genes, geralmente utilizada em laboratórios e em animais domésticos foi desenvolvida pioneiramente utilizando camundongos como modelo experimental. O uso de grandes animais como transgênicos é justificado pela possibilidade da glândula mamária de animais modificados expressar proteínas heterólogas de interesses nutricional e farmacêutico. Neste contexto, bovinos transgênicos podem ser usados para produzir proteínas em grandes quantidades e a custos reduzidos. Apesar dos avanços, a técnica de transgenia ainda oferece, quando extrapolada para outras espécies desvantagens como a baixa eficiência da microinjeção no pronúcleo, a reduzida quantidade de oócitos recuperados para a microinjeção em vacas, porcas e ovelhas, mesmo em animais superovulados e o longo período de gestação desses animais de produção em comparação ao camundongo, o que acarreta em custos mais elevados. Para contornar estas dificuldades, métodos alternativos têm sido desenvolvidos. O uso de espermatozóides como vetores tem sido descrito por diversos autores. Desde a década de 70 é sabido que os espermatozóides de quase todas as espécies se ligam à proteínas e ao DNA exógeno, portanto essas células podem ser usadas como vetores para introduzir moléculas de DNA em um oócito durante o processo de fecundação. Este trabalho teve como objetivo comparar quatro métodos de incorporação de DNA exógeno ao espermatozóide e verificar a eficiência da produção in vitro de embriões bovinos transgênicos. Para tanto, espermatozóides foram eletroporados (500V), capacitados com cálcio ionóforo (250nM), incubados por 1 hora ou associados à lipossomos, na presença do DNA exógeno pEYFP-Nuc. Os espermatozóides submetidos a estes tratamentos foram utilizados na produção in vitro de embriões bovinos. Os métodos foram avaliados quanto aos índices de clivagem, de blastocisto e de eclosão, por Qui-quadrado com nível de significância de 5%. A incorporação de DNA exógeno foi avaliada pela PCR, sendo positivo os embriões que na eletroforese em gel de agarose apresentaram uma banda de 440pb. Não houve diferença significativa entre os índices de blastocisto e de eclosão dos grupos experimentais quando comparado ao grupo controle. Os embriões positivos na PCR para pEYFP-Nuc nos grupos capacitação (10,52%) e eletroporação (21,84%) não apresentaram diferença entre si, contudo foram mais eficientes em comparação ao grupo lipofecção (10,0%). O grupo da incubação (11,32%) não difere dos demais grupos experimentais. Estes resultados permitem concluir que é possível produzir embriões bovinos transgênicos in vitro utilizando espermatozóides tratados por eletroporação, capacitação espermática, lipofecção e incubação espermática para a incorporação do DNA exógeno
Biblioteca responsável: BR68.1