Padronização e avaliação de um teste de elisa competitivo utilizando a proteína recombinante msp5-pr1 para o diagnóstico sorológico da anaplasmose bovina
Marana, Elizabete Regina Marangoni.
Tese
em Português
| VETTESES
| ID: vtt-8923
Resumo
Anaplasma marginale (Rickettsiales: Anaplasmataceae) é o agente etiológico da anaplasmose bovina que se encontra distribuída mundialmente afetando regiões tropicais e subtropicais. É transmitido por vetores, sendo a doença caracterizada clinicamente por febre, anemia hemolítica, perda de peso, aborto e morte. A. marginale possui seis Proteínas Majoritárias de Superfície (MSPs) caracterizadas e designadas MSP1a (105 kDa), MSP1b (100 kDa), MSP2 (36 kDa), MSP3 (86 kDa), MSP4 (31 kDa), MSP5 (19 kDa). Estas proteínas estão envolvidas em importantes eventos entre as células do hospedeiro e o parasita, como respostas humoral e celular, transporte de nutrientes, adesão e invasão de eritrócitos e variação antigênica. A MSP5 é uma proteína altamente conservada entre o isolados estudados de diferentes regiões geográficas, inclusive centrale de Anaplasma centrale e A. ovis. O presente trabalho teve como objetivo padronizar e avaliar um teste imunoenzimático um teste imunoenzimático competitivo (cELISA-PR1), utilizando a rMSP5 do isolado PR1 de A. marginale desenvolvido para o diagnóstico sorológico de anaplasmose. O gene msp5 foi clonado no plasmídio pRSETB e expresso em Escherichia coli BL21 Star (DE3) One Shot (Invitrogen®). O seqüenciamento do gene msp5 mostrou 98% identidade com os isolados Florida e Saint Maries, 97% com isolados Brasil-Pernambuco e Havana; e 91% com A. centrale. A proteína recombinante rMSP5 a partir do isolado PR1 (rMSP5-PR1) foi reconhecida pelo anticorpo de monoclonal ANAF16C1 em Western blotting. O cELISA-PR1 e a IFI foram comparados com cELISA pela análise de 283 soros bovinos, sendo 135 amostras negativas oriundas da região de Santa Vitória do Palmar - RS, e 147 amostras de soros positivas de bovinos naturalmente infectados com A. marginale que obtiveram densidade óptica inferior a 0,490 em 490nm (DO490) através do cELISA foram selecionadas de 245 amostras da região Sul do Brasil. Os testes apresentaram especificidade de 100% e 99,3%, sensibilidade de 100% e 98%, com um coeficiente kappa de 0,993 e 0,978, respectivamente. Na comparação de cELISA-PR1 e IFI com cELISA, a análise de 245 amostras de soros de bovinos naturalmente infectados com A. marginale na região de Sul do Brasil apresentou uma prevalência de 77,55%, 81,63% e 76,73% respectivamente, com especificidade de 96,7% e 98,9%, sensibilidade de 98,9%, 96,3% e um coeficiente kappa de 0,956 e 0,699, respectivamente. Conclui-se, através dos resultados obtidos, que cELISA-PR1 pode ter uso semelhante ao cELISA em testes diagnósticos contra A. marginale durante a infecção aguda, avaliação sorológica, e identificação de bovinos portadores sãos. A soroprevalência de A. marginale foi determinada em 223 amostras de soros de bovinos com dois anos de idade ou mais, da Região de Centro-Sul no Estado de Paraná: região de Ponta Grossa, Guarapuava e Laranjeiras; através da pesquisa de anticorpos da classe IgG contra A. marginale por ensaio imunoenzimático de competição cELISA-PR1. De todos os soros bovinos analisados, 130 (58,74%) reagiram ao cELISA-PR1, uma porcentagem significativa de animais, sendo esta região de instabilidade de enzoótica, susceptível à infecção por A. marginale e ao desenvolvimento de anaplasmose. O tipo de exploração da propriedade, sistema de criação e manejo, a presença de outros animais (ovino, caprino, eqüinos, animais silvestres), forma de comercialização de animais não apresentou diferença significativa entre as variáveis analisadas aprese
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