Produção, caracterização e avaliação da imunogenicidade do complexo protéico MSP1 recombinante (rMSP1a e rMSP1b) de isolado paranaense do Anaplasma marginale
Tamekuni, Katia.
Tese
em Português
| VETTESES
| ID: vtt-8934
Resumo
O Anaplasma marginale (ordem Rickettsiales, família Anaplasmataceae) é o agente etiológico da anaplasmose bovina. Esta doença ocorre mundialmente, com maior freqüência nas regiões tropicais e subtropicais, determinando perdas econômicas consideráveis à pecuária bovina. O A. marginale possui seis proteínas principais de superfície designadas de MSP1a, MSP1b, MSP2, MSP3, MSP4, MSP5. A proteína MSP1a tem massa molecular de 105kDa e a MSP1b de 100kDa. Os objetivos deste trabalho foram clonar, produzir, caracterizar as MSP1a e MSP1b recombinantes (rMSP1a e rMSP1b) e avaliar a resposta imune humoral de camundongos imunizados com a Escherichia coli BL21 recombinante expressando estas proteínas. Os genes msp1? e msp1? foram obtidos pela PCR de um isolado Paranaense de A. marginale e clonados em vetores pET102 e pET101/D-TOPO, respectivamente. Após a certificação da inserção dos genes nos vetores, as proteínas foram induzidas com IPTG e purificadas em colunas de resina ligadas ao níquel. As proteínas rMSP1a e rMSP1b separadas em SDS-PAGE, reagiram com soros anti-rMSP1a e anti-rMSP1b produzidos em coelhos, pelo Western blotting, mostrando massas moleculares de 70kDa a 105kDa e 100kDa, respectivamente. A BL21/rMSP1a e a BL21/rMSP1b aglutinaram as hemácias de bovinos e esta hemaglutinação foi inibida na presença de IgY anti-rMSP1a e anti-rMSP1b, confirmando a função de adesão destas proteínas. A reação de IFI realizada com as IgY anti-rMSP1a e IgY anti-rMSP1b, produzidas em galinhas, demonstraram a presença destas proteínas na membrana externa das E. coli BL21 recombinantes. As BL21/rMSP1a e BL21/rMSP1b também foram utilizadas para imunizar camundongos Balb/c para avaliação de produção de IgG total e IgG2a, por meio de técnica de ELISA. Os animais imunizados com BL21/rMSP1a tiveram uma forte resposta humoral (IgG total e IgG2a), enquanto que os camundongos imunizados com a BL21/rMSP1b apresentaram uma fraca resposta após as três primeiras imunizações. Pelo Western blotting foi detectado, resposta de IgG total contra as proteínas rMSP1a e rMSP1b. Soros de camundongos imunizados com BL21/rMSP1a reagiram com a BL21 e rMSP1a com massas moleculares variando de 70 a 105 kDa e uma banda de 20 kDa sugerindo a quebra da proteína. Soros de animais imunizados com a BL21/rMSP1b reagiram com a BL21 e rMSP1b com massa molecular de 100 kDa. Os resultados deste trabalho confirmam o papel das MSP1a e MSP1b como adesinas no processo de invasão de eritrócitos e evidenciam a importância destas proteínas na elaboração de uma vacina de subunidades para o controle da anaplasmose bovina. Também demonstram que as BL21 expressando as rMSP1a e a rMSP1b na membrana externa são capazes de produzir resposta imune em camundongos
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BR68.1