AVALIAÇÃO DA RESPOSTA IMUNE HUMORAL EM CAMUNDONGOS BALB/C À PROTEÍNAS PRINCIPAIS DE SUPERFÍCIES (MSPs) RECOMBINANTES DE Anaplasma marginale AGREGADAS À DIFERENTES ADJUVANTES

RESUMO

Anaplasmose é uma doença febril e hemolítica de bovinos, causada pelo Anaplasma marginale (Família Anaplasmataceae). A doença acomete principalmente bovinos das regiões tropicais e subtropicais, podendo provocar anemia, febre, perda de peso, aborto e morte. A membrana externa do A. marginale inclui seis proteínas principais de superfície (MSPs) bem caracterizadas, designadas de MSP1, MSP2, MSP3, MSP4 e MSP5. Os objetivos deste trabalho foram a clonagem e caracterização da proteína MSP4 recombinante (rMSP4) e a avaliação da resposta imune humoral de camundongos Balb/c contra as proteínas recombinantes MSP1a, MSP1b, MSP4 e MSP5 agregadas a diferentes adjuvantes. O gene msp4 de um isolado Paranaense de A. marginale apresentou 99% de homologia com outros isolados brasileiros. A clonagem do gene msp4 no vetor pET102/D-TOPO? resultando na construção recombinante (msp4+6xHis-V5-HP tireodoxina), expressou a rMSP4 na Escherichia coli BL21 (DE-3). A rMSP4 purificada em grande quantidade foi utilizada para imunizar coelhos. A rMSP4 e a MSP4 nativa foram reconhecidas pelo soro pós-imune dos coelhos, mostrando que a rMSP4 apresenta epítopos coservados e sua antigenicidade preservada. ISCOMs são complexos coloidais estáveis e carreadores efetivos de vacinas de subunidade, podendo reconstituir a disposição natural das proteínas recombinantes. As vacinas ISCOM/rMSPs e ISCOMATRIX/rMSPs foram produzidas pela técnica de liofilização e utilizadas na imunização de camundongos Balb/C. A avaliação da resposta imune humoral foi realizada pelo ELISA indireto e Western blotting. A presença de estruturas típicas do ISCOM/rMSPs e ISCOMATRIX foi evidenciada por microscopia eletrônica e a presença das rMSPs demonstrada por Western blotting. Os grupos controle negativo (0,1 mL de salina) e o controle do ISCOMATRIX adjuvante não produziram IgG e IgG2a. Os animais imunizados com ISCOM/rMSPs e vacina ISCOMATRIX/rMSPs produziram IgG total e IgG2a, e a maior resposta foi de IgG2a sugerindo uma resposta celular. O soro dos animais imunizados com A. marginale e com as rMSPs agreagadas aos diferentes adjuvantes reagiram com as rMSPs especificamente pelo Western blotting, evidenciando a rMSP1a (60 a 105 kDa), rMSP1b (100 kDa), rMSP4 (47 kDa) e rMSP5 (29 kDa). Futuros estudos nos permitirão a avaliação humoral e celular destas vacinas de subunidade em bovinos e sua magnitude como vacina protetora contra cepas homólogas e heterólogas