Leveduras associadas à cloaca e a excrementos de pombos (Columba livia): um enfoque especial para os aspectos micológicos de Cryptococcus spp / Yeasts associated with pigeon droppings and cloaca (Columba livia): a special focus for the mycological aspects of Cryptococcus spp

RESUMO

Aves industriais, domésticas e silvestres têm sido implicadas como possíveis carreadores de fungos patogênicos, tais como Cryptococcus spp. e Candida spp. Em especial, diversos estudos têm detectado a presença de Cryptococcus spp. em fezes de psitaciformes, passeriformes, columbiformes e falconiformes. Para investigar a ocorrência de Cryptococcus spp., assim como de outras leveduras na cloaca e fezes de pombos, 47 amostras de excrementos e 322 amostras provenientes da cloaca foram coletadas na cidade de Fortaleza-Ceará, Brasil. As amostras de fezes suspensas em solução fisiológica estéril (0,9%) e as da cloaca foram semeadas em meio ágar semente de niger (ASN) e ácido caféico modificado (ACM). As colônias leveduriformes eram subcultivadas em ágar Sabouraud 2% para a identificação fúngica por meio de testes micológicos específicos. Para a identificação de Cryptococcus spp. foram realizados os seguintes procedimentos crescimento em meio L-canavanina azul de bromotimol (CGB), auxonograma em API 20C e PCR. A partir das fezes dos pombos, foi possível isolar C. neoformans var. neoformans. (n=10), C. laurentii (n=3), C. albicans (n=9), C. tropicalis (n=3), C. krusei (n=1), C. parapsilosis (n=1), Rhodotorula sp. (n=6), Trichosporon sp. (n=3); enquanto da cloaca isoloram-se C. albicans (n=3), C. tropicalis (n=1), Trichosporon sp. (n=3) and Rhodotorula sp. (n=2). Outro objetivo deste estudo foi investigar a sensibilidade, in vitro, de cepas ambientais e humanas de Cryptococcus spp., através da técnica da microdiluição em caldo preconizada pelo CLSI, (M27-A2). Assim, foram testadas as 10 cepas de C. neoformans var. neoformans e as três cepas de C. laurentii isoladas neste estudo, bem como foram incluídas no teste seis cepas de C. neoformans var. neoformans, obtidas de amostras clínicas humanas e estocadas em nossa micoteca. Entre os isolados ambientais, a resistência só foi detectada em uma única cepa de C. neoformans var. neoformans para o itraconazol (CIM=1g/mL). Dentre as seis cepas de C. neoformans var. neoformans humanas foi observado o seguinte padrão de resistência itraconazol (n=1), fluconazol (n=3), anfotericina B (n=4). Ademais, foi detectada a presença de multiresistência entre as cepas humanas para fluconazol e anfotericina B (n=2) e para itraconazol e anfotericina B (n=1). Todos os isolados humanos e ambientais foram resistentes a caspofungina. O último objetivo deste estudo foi investigar a capacidade das lectinas como marcadores biológicos de C. neoformans var. neoformans. Para tanto, foi realizado um ensaio de fluorescência direta utilizando lectinas marcadas. Neste protocolo foram testadas cinco cepas de C. neoformans var. neoformans e cinco lectinas (Dioclea violácea - DVL, Cratilya floribunda - CFL, Dioclea grandiflora - DGL, Canavalia braziliensis - ConBr e Dioclea virgata DVG). O padrão de marcação das lectinas foi classificado como +++ (intenso), ++ (moderado), + (discreto) e (ausente). A lectina DVL foi a que apresentou a melhor capacidade de ligação nas cepas de C. neoformans var. neoformans, seguida por CFL, ConBr, DGL e DVG. Em suma, o presente estudo mostrou a importância dos pombos na disseminação de Cryptococcus spp., Candida spp., Rhodotorula sp e Trichosporon sp., bem como detectou resistência antifúngica em cepas de C. neoformans var. neoformans. Por fim, demonstrou a capacidade de lectinas, particularmente a DVL, para a marcação de C. neoformans var. neoformans

ABSTRACT

Industrials, domestic and wild birds are known to act as possible carriers of pathogenic fungi such as Cryptococcus spp. e Candida spp. In particular, several studies have been detected the occurrence of Cryptococcus spp. from bird excrements in psittaciformes, passeriformes, columbiformes and falconiformes. In order to investigate the occurrence of Cryptococcus spp. as well as others yeasts in the cloacae and feces of pigeons, 47 samples of pigeon droppings and 322 samples from pigeon cloacae were collected in the city of Fortaleza-Ceará, Brazil. Feces samples suspended in sterile saline and cloacae swabs were smeared on niger seed agar medium (NSA) and on minimal synthetic caffeic acid medium (MSCAM). Yeast-like colonies were subcultured in Sabouraud glucose agar 2% for fungal identification by specific mycologic tests. For identification of Cryptococcus spp., growth in L-canavanine-glicyne-bromothymol blue (CGB), identification by auxanogram on API 20C and PCR were performed. C. neoformans var. neoformans. (n=10), C. laurentii (n=3), C. albicans (n=9), C. tropicalis (n=3), C. krusei (n=1), C. parapsilosis (n=1), Rhodotorula sp. (n=6), Trichosporon sp. (n=3) were isolated from the pigeon droppings. C. albicans (n=3), C. tropicalis (n=1), Trichosporon sp. (n=3) and Rhodotorula sp. (n=2). were recovered from the cloacae. Furthermore, the in vitro antifungal susceptibility of the environmental and human strains of Cryptococcus spp. was investigated by the microdiluition method as recommended by CLSI (M27-A2). Thus, the 10 isolates of C. neoformans var. neoformans and the three isolates of C. laurentii here isolated, as well as six strains of C. neoformans var. neoformans from human, stored in our fungal culture collection, were tested in this study. Among the environmental Cryptococcus, resistance was detected in only one strain of C. neoformans var. neoformans, which was resistant to itraconazole (MIC=1g/ml). However, from the six human strains the following resistances were observed itraconazole (n=1), fluconazole (n=3) e amphotericin B (n=4), In addition, multiresistance was detected in human strains to fluconazole and amphotericin B (n=2) and to itraconazole and amphotericin B (n=1). All environmental and clinical isolates were resistant to caspofungin. Finally, it was investigate the lectins ability to binding C. neoformans cells by direct fluorescence using labeled lectins. For that, five C. neoformans var. neoformans strains and five lectins (Dioclea violacea - DVL, Cratilya floribunda - CFL, Dioclea grandiflora - DGL, Canavalia braziliensis - ConBr e Dioclea virgata DVG) were tested. The binding pattern was classified as follows +++ (intense), ++ (moderate), + (discreet) e (absent). The DVL was the lectin that showed better ability to binding to C. neoformans var. neoformans cells, fllowed by CFL, ConBr, DGL e DVG. Summary, the present study showed the importance of pigeons in disseminating Cryptococcus spp., Candida spp., Trichosporon sp. and Rhodotorula sp., and additionally, it evidenced some antifungal resistance in C. neoformans var. neoformans. Finally, it was observed that lectins, especially DVL, are able to binding to C. neoformans cells