Produção e aplicação de imunoglobulinas Y anti-leptospira
Tavares, Tatiane Cristina Fernandes.
Tese
em Português
| VETTESES
| ID: vtt-981
Resumo
A dissertação foi dividida em dois estudos. No primeiro estudo objetivou-se verificar se galinhas imunizadas com uma solução de Leptospiras inativadas e proteínas de membrana externa do sorovar Hardjo, poderiam produzir anticorpos policlonais específicos anti-Leptospiras, detectáveis em testes ELISA. Foram imunizados oito galinhas com 25 semanas de idade, da raça White Leghorn, sendo três imunizadas com uma suspensão de Leptospiras inativadas, três com uma solução de proteínas de membrana externa extraída do sorovar Hardjo e duas controle. Coletas de sangue foram realizadas quinzenalmente e de ovos diariamente. A IgY foi purificada a partir da gema dos ovos utilizando para a delipidação o método de diluição em água ácida e a precipitação com sulfato de amônio. Realizou-se testes ELISA para verificar a especificidade da IgY, nestes foi possível observar a produção de anticorpos anti-Leptospira, tanto no soro quanto nas gemas purificadas. O pico de produção de anticorpos específicos ocorreu na 5º semana após a primeira imunização. Foi possível induzir a produção de anticorpos específicos em galinhas, por meio de imunizações destas com Leptospira inativada e proteínas de membrana externa do sorovar Hardjo. Galinhas imunizadas com uma suspensão de Leptospiras inativadas e com PME de Leptospira interrogans do sorovar Hardjo produziram anticorpos reativos a PME Hardjo detectáves por teste ELISA. No segundo estudo objetivou-se com identificar epítopos ou mimetopos (sequências que imitam epítopos verdadeiros), por meio da técnica de phage display tendo como alvo anticorpos IgY anti-Leptospira e anti-PME Hardjo. Os anticorpos IgY utilizados como alvo foram produzidos em galinhas imunizadas com proteínas de membrana externa de Leptospira interrogans sorovar sorovar Hardjo (anti-PME Hardjo), suspensão de Leptospiras inativada (anti-Leptospira) e IgY controle. No biopanning uma biblioteca comercial de peptídeos randômicos Ph.D. 12 mer, New England BioLabs®Inc foi incubada primeiramente com a IgY controle, realizando um processo denominado seleção negativa e depois com a IgY anti-Leptospira e anti-PME Hardjo, a eluição dos fagos selecionados foi então realizada de forma competitiva e ácida. Após três ciclos de seleção, 288 clones foram isolados e sequenciados, gerando 132 sequências válidas. Os clones foram submetidos a testes ELISA com o anticorpo usado como alvo no biopanning para verificar a especificidade destes. Nos resultados dos testes ELISAs verificou-se que nove fagos (PMEcomp17, PMEac10, PMEac12, PMEac19, PMEac29, PMEac35, Lep6, Lep7 e Lep20) apresentaram melhores resultados. Estes foram alinhados com a sequência primária de proteínas de Leptospira spp e Leptospira interrogans sorovar Hardjo, e as análises in Silico mostraram que os nove peptídeos têm similaridade com proteínas imunogênicas de Leptospiras. Foram selecionados nove peptídeos com similaridade a proteínas de Leptospira interrogans consideradas imunogênicas. Os peptídeos foram similares a proteínas de membrana externa, lipoproteína, LipL32, LipL41, LigA, SecY, LenE
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BR68.1