Establishing a Standardized DNA Extraction Method Using NaCl from Oral Mucosa Cells for Its Application in Imprinting Diseases Such as Prader-Willi and Angelman Syndromes: A Preliminary Investigation.

BACKGROUND: Diagnosing imprinting defects in neonates and young children presents challenges, often necessitating molecular analysis for a conclusive diagnosis. The isolation of genetic material from oral swabs becomes crucial, especially in settings where blood sample collection is impractical or for vulnerable populations like newborns, who possess limited blood volumes and are often too fragile for invasive procedures. Oral swab samples emerge as an excellent source of DNA, effectively overcoming obstacles associated with rare diseases. METHODS: In our study, we specifically addressed the determination of the quality and quantity of DNA extracted from oral swab samples using NaCl procedures. RESULTS: We compared these results with extractions performed using a commercial kit. Subsequently, the obtained material underwent MS-HRM analysis for loci associated with imprinting diseases such as Prader-Willi and Angelman syndromes. CONCLUSIONS: Our study emphasizes the significance of oral swab samples as a reliable source for obtaining DNA for MS-HRM analysis. NaCl extraction stands out as a practical and cost-effective method for genetic studies, contributing to a molecular diagnosis that proves particularly beneficial for patients facing delays in characterization, ultimately influencing their treatment.

A newborn screening pilot study using methylation-sensitive high resolution melting on dried blood spots to detect Prader-Willi and Angelman syndromes.

Prader-Willi (PWS) and Angelman (AS) syndromes are two clinically distinct imprinted disorders characterized by genetic abnormalities at 15q11-q13. Early diagnosis of both syndromes provides improved treatment and accurate genetic counseling. Whole blood (WB) is the most common DNA source of many methodologies to detect PWS and AS, however, the need of WB makes a massive screening difficult in newborns due to economic and technical limitations. The aim of this study was to adapt a Methylation-sensitive High-Resolution Melting (MS-HRM) approach from dried blood spot (DBS) samples, assessing the different DNA isolation techniques and diagnostic performance. Over a 1-year period, we collected 125 DBS cards, of which 45 had already been diagnosed by MS-HRM (20 PWS, 1 AS, and 24 healthy individuals). We tested three different DBS-DNA extraction techniques assessing the DNA concentration and quality, followed by MS-HRM and statistical comparison. Each DBS-DNA extraction method was capable of accuracy in detecting all PWS and AS individuals. However, the efficiency to detect healthy individuals varied according to methodology. In our experience, DNA extracted from DBS analyzed by the MS-HRM methodology provides an accurate approach for genetic screening of imprinting related disorders in newborns, offering several benefits compared to traditional whole blood methods.

Genotype-Phenotype Relationships and Endocrine Findings in Prader-Willi Syndrome.

Prader-Willi syndrome (PWS) is a complex imprinting disorder related to genomic errors that inactivate paternally-inherited genes on chromosome 15q11-q13 with severe implications on endocrine, cognitive and neurologic systems, metabolism, and behavior. The absence of expression of one or more genes at the PWS critical region contributes to different phenotypes. There are three molecular mechanisms of occurrence: paternal deletion of the 15q11-q13 region; maternal uniparental disomy 15; or imprinting defects. Although there is a clinical diagnostic consensus criteria, DNA methylation status must be confirmed through genetic testing. The endocrine system can be the most affected in PWS, and growth hormone replacement therapy provides improvement in growth, body composition, and behavioral and physical attributes. A key feature of the syndrome is the hypothalamic dysfunction that may be the basis of several endocrine symptoms. Clinical and molecular complexity in PWS enhances the importance of genetic diagnosis in therapeutic definition and genetic counseling. So far, no single gene mutation has been described to contribute to this genetic disorder or related to any exclusive symptoms. Here we proposed to review individually disrupted genes within the PWS critical region and their reported clinical phenotypes related to the syndrome. While genes such as MKRN3, MAGEL2, NDN, or SNORD115 do not address the full spectrum of PWS symptoms and are less likely to have causal implications in PWS major clinical signs, SNORD116 has emerged as a critical, and possibly, a determinant candidate in PWS, in the recent years. Besides that, the understanding of the biology of the PWS SNORD genes is fairly low at the present. These non-coding RNAs exhibit all the hallmarks of RNA methylation guides and can be incorporated into ribonucleoprotein complexes with possible hypothalamic and endocrine functions. Also, DNA conservation between SNORD sequences across placental mammals strongly suggests that they have a functional role as RNA entities on an evolutionary basis. The broad clinical spectrum observed in PWS and the absence of a clear genotype-phenotype specific correlation imply that the numerous genes involved in the syndrome have an additive deleterious effect on different phenotypes when deficiently expressed.

A rapid and accurate methylation-sensitive high-resolution melting analysis assay for the diagnosis of Prader Willi and Angelman patients

Fundo: As síndromes de Prader Willi (PWS) e Angelman (AS) são raros distúrbios genéticos caracterizados por deleções, disomias uniparentais e defeitos de impressão no cromossomo 15. A perda de função de genes específicos causados ​​por alterações genéticas no alelo paterno causa SPW enquanto a ausência na mãe resultados do alelo AS. O diagnóstico laboratorial de SPW e SA é complexo e exige técnicas de biologia molecular e citogenética para identificar o mecanismo genético relacionado ao desenvolvimento da doença. A análise de metilação do DNA no cromossomo 15 no locus SNURF ­ SNRPN através do MS ­ PCR confirma o diagnóstico e distingue entre PWS e AS. Nosso estudo teve como objetivo estabelecer a técnica MS ­ PCR associada ao derretimento de alta resolução (MS ­ HRM) no diagnóstico de SPW e SA com um único par de primers. Métodos: Coletamos amostras de sangue de 43 pacientes suspeitos para uma análise citogenética e de metilação. O DNA extraído foi tratado com bissulfito para realizar análises comparativas de metilação. Resultados: MS ­ HRM e MS ­ PCR concordaram em 100% dos casos, identificando 19 (44%) SPW, 3 (7%) AS e 21 (49%) Normal. A análise FISH detectou quatro casos de SPW causados ​​por deleções no cromossomo 15. Conclusão: O MS ­ HRM apresentou bom desempenho com um par exclusivo de primers, dispensando a análise de gel de eletroforese, oferecendo um diagnóstico rápido e reprodutível.

Aplicação do sequenciamento de nova geração no diagnóstico molecular da síndrome de Prader-Willi / Application of next-generation sequencing in the molecular diagnosis of Prader-Willi syndrome

Introdução: A síndrome de Prader- Willi (SPW) é uma desordem genética complexa, caracterizada por deleções, dissomia uniparental materna ou defeito no centro de imprinting no alelo paterno do cromossomo 15. As perdas de funções de genes específicos da região 15q11 afetam múltiplos sistemas corporais. O diagnóstico da SPW envolve a realização de diversas técnicas de biologia molecular e citogenética para a completa elucidação do mecanismo genético relacionado ao desenvolvimento da síndrome, tornando todo o processo laborioso, demorado e custoso. Objetivo: Aplicação da tecnologia sequenciamento de nova geração (NGS), plataforma Ion Torrent PGM, para diagnostico molecular da SPW. Materiais e Métodos: Foram incluídos 17 pacientes suspeitos para SPW onde foram submetidos a análise de metilação (MS-HRM), citogenética (GTG e FISH) e sequenciamento de genes alvos na plataforma Ion Torrent PGM, e subsequente confirmação de variantes através da técnica de sequenciamento de Sanger. Resultados: A análise de metilação detectou 6 indivíduos portadores da SPW, 1 portador da Síndrome de Angelman (SA) e 10 indivíduos normais. A técnica de GTG identificou 1 indivíduo com uma grande perda cromossômica, já a metodologia de FISH identificou 3 indivíduos com deleções, totalizando 4. O bom desempenho da tecnologia de sequenciamento NGS, através da metodologia Ion Torrent PGM, permitiu a realização de análises de frequência alélica, variação do número de cópias (CNV) e de mutações específicas do genoma. As análises por bioinformática realizadas nos dados do NGS permitiram detectar 4 pacientes portadores de deleção, classificando-as como Tipo 1 ou Tipo 2. Além disso, foi possível identificar um evento raro de dissomia uniparental segmentar, com complicações prognósticas severas. Identificou-se variantes do tipo INDEL no gene PWRN1 em 2 pacientes, onde, o impacto funcional desta mutação ainda não foi estudado. Contudo o gene possui forte correlação com o desenvolvimento da SPW. A metodologia também identificou uma mutação INDEL no gene MAGEL2 em um paciente com padrão de metilação normal no MS-HRM, sugerindo a identificação de uma síndrome análoga a SPW. Todas as variantes detectadas foram validadas através do sequenciamento de Sanger. Conclusão: A plataforma Ion Torrent identificadou todas as alterações relacionadas ao desenvolvimento da SPW. O pipeline desenvolvido mostrou-se aplicável a uma rotina diagnóstica.

Introduction: Prader-Willi syndrome (PWS) is a complex genetic disorder characterized by deletions, maternal uniparental disomy or defect at the imprinting center in the paternal allele of chromosome 15. Loss of 15q11 region-specific gene functions affects multiple body systems. The diagnosis of SPW involves the accomplishment of several techniques of molecular biology and cytogenetics for the complete elucidation of the genetic mechanism related to the development of the syndrome, making the whole process laborious, time-consuming and costly. Objective: Application of the Next-Generation sequencing technology (NGS), platform Ion Torrent PGM, for molecular diagnosis of PWS. Materials and Methods: Seventeen suspected patients for SPW were submitted to methylation (MS-HRM), cytogenetic analysis (GTG and FISH) and sequencing of target genes in the Ion Torrent PGM platform, and subsequent confirmation of variants by the technique of sequencing of Sanger. Results: Methylation analysis detected 6 individuals with SPW, 1 with Angelman Syndrome (AS) and 10 normal individuals. The GTG technique identified 1 individual with a large chromosomal loss, and the FISH methodology identified 3 individuals with deletions, totaling 4. The good performance of the NGS sequencing technology, through the Ion Torrent PGM methodology, allowed the performance of frequency analyzes allelic, copy number variation (CNV), and genome-specific mutations. The bioinformatics analyses performed on the NGS data allowed the detection of 4 patients with deletion, classifying them as Type 1 or Type 2. In addition, it was possible to identify a rare segmental uniparental disomy with severe prognostic complications. Variables of the INDEL type were identified in the PWRN1 gene in 2 patients, where the functional impact of this mutation has not been studied. However, the gene has a strong correlation with the development of PWS. The methodology also identified an INDEL mutation in the MAGEL2 gene in a patient with normal methylation pattern in MS-HRM, suggesting the identification of a syndrome similar to PWS. All detected variants were validated through Sanger sequencing. Conclusion: The Ion Torrent platform has identified all the changes related to the development of PWS. The pipeline developed proved to be applicable to a diagnostic routine.

Aplicação do sequenciamento de nova geração no diagnóstico molecular da síndrome de Prader-Willi

Introdução: A síndrome de Prader- Willi (SPW) é uma desordem genética complexa, caracterizada por deleções, dissomia uniparental materna ou defeito no centro de imprinting no alelo paterno do cromossomo 15. As perdas de funções de genes específicos da região 15q11 afetam múltiplos sistemas corporais. O diagnóstico da SPW envolve a realização de diversas técnicas de biologia molecular e citogenética para a completa elucidação do mecanismo genético relacionado ao desenvolvimento da síndrome, tornando todo o processo laborioso, demorado e custoso. Objetivo: Aplicação da tecnologia sequenciamento de nova geração (NGS), plataforma Ion Torrent PGM, para diagnostico molecular da SPW. Materiais e Métodos: Foram incluídos 17 pacientes suspeitos para SPW onde foram submetidos a análise de metilação (MS-HRM), citogenética (GTG e FISH) e sequenciamento de genes alvos na plataforma Ion Torrent PGM, e subsequente confirmação de variantes através da técnica de sequenciamento de Sanger. Resultados: A análise de metilação detectou 6 indivíduos portadores da SPW, 1 portador da Síndrome de Angelman (SA) e 10 indivíduos normais. A técnica de GTG identificou 1 indivíduo com uma grande perda cromossômica, já a metodologia de FISH identificou 3 indivíduos com deleções, totalizando 4. O bom desempenho da tecnologia de sequenciamento NGS, através da metodologia Ion Torrent PGM, permitiu a realização de análises de frequência alélica, variação do número de cópias (CNV) e de mutações específicas do genoma. As análises por bioinformática realizadas nos dados do NGS permitiram detectar 4 pacientes portadores de deleção, classificando-as como Tipo 1 ou Tipo 2. Além disso, foi possível identificar um evento raro de dissomia uniparental segmentar, com complicações prognósticas severas Identificou-se variantes do tipo INDEL no gene PWRN1 em 2 pacientes, onde, o impacto funcional desta mutação ainda não foi estudado. Contudo o gene possui forte correlação com o desenvolvimento da SPW. A metodologia também identificou uma mutação INDEL no gene MAGEL2 em um paciente com padrão de metilação normal no MS-HRM, sugerindo a identificação de uma síndrome análoga a SPW. Todas as variantes detectadas foram validadas através do sequenciamento de Sanger. Conclusão: A plataforma Ion Torrent identificadou todas as alterações relacionadas ao desenvolvimento da SPW. O pipeline desenvolvido mostrou-se aplicável a uma rotina diagnóstica.