Development and validation of PCR-based assays for diagnosis of American cutaneous leishmaniasis and identification of the parasite species.

In this study, PCR assays targeting different Leishmania heat-shock protein 70 gene (hsp70) regions, producing fragments ranging in size from 230-390 bp were developed and evaluated to determine their potential as a tool for the specific molecular diagnosis of cutaneous leishmaniasis (CL). A total of 70 Leishmania strains were analysed, including seven reference strains (RS) and 63 previously typed strains. Analysis of the RS indicated a specific region of 234 bp in the hsp70 gene as a valid target that was highly sensitive for detection of Leishmania species DNA with capacity of distinguishing all analyzed species, after polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism (PCR-RFLP). This PCR assay was compared with other PCR targets used for the molecular diagnosis of leishmaniasis: hsp70 (1400-bp region), internal transcribed spacer (ITS)1 and glucose-6-phosphate dehydrogenase (G6pd). A good agreement among the methods was observed concerning the Leishmania species identification. Moreover, to evaluate the potential for molecular diagnosis, we compared the PCR targets hsp70-234 bp, ITS1, G6pd and mkDNA using a panel of 99 DNA samples from tissue fragments collected from patients with confirmed CL. Both PCR-hsp70-234 bp and PCR-ITS1 detected Leishmania DNA in more than 70% of the samples. However, using hsp70-234 bp PCR-RFLP, identification of all of the Leishmania species associated with CL in Brazil can be achieved employing a simpler and cheaper electrophoresis protocol.

Development and validation of PCR-based assays for diagnosis of American cutaneous leishmaniasis and identificatio nof the parasite species

In this study, PCR assays targeting different Leishmania heat-shock protein 70 gene (hsp70) regions, producing fragments ranging in size from 230-390 bp were developed and evaluated to determine their potential as a tool for the specific molecular diagnosis of cutaneous leishmaniasis (CL). A total of 70 Leishmania strains were analysed, including seven reference strains (RS) and 63 previously typed strains. Analysis of the RS indicated a specific region of 234 bp in the hsp70 gene as a valid target that was highly sensitive for detection of Leishmania species DNA with capacity of distinguishing all analyzed species, after polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorfism (PCR-RFLP). This PCR assay was compared with other PCR targets used for the molecular diagnosis of leishmaniasis: hsp70 (1400-bp region), internal transcribed spacer (ITS)1 and glucose-6-phosphate dehydrogenase (G6pd). A good agreement among the methods was observed concerning the Leishmania species identification. Moreover, to evaluate the potential for molecular diagnosis, we compared the PCR targets hsp70-234 bp, ITS1, G6pd and mkDNA using a panel of 99 DNA samples from tissue fragments collected from patients with confirmed CL. Both PCR-hsp70-234 bp and PCR-ITS1 detected Leishmania DNA in more than 70% of the samples. However, using hsp70-234 bp PCR-RFLP, identification of all of the Leishmania species associated with CL in Brazil can be achieved employing a simpler and cheaper electrophoresis protocol.

Análise de alvos moleculares quanto ao potencial de uso como \201CDNA Barcode\201D para identificação de espécies de Leishmania

O gênero Leishmania foi descrito pela primeira vez em 1903 e a partir daí um grande número de espécies foi descrito. Embora os esquemas taxonômicos tem utilizado cada vez mais características intrínsecas para identificar as espécies de Leishmania, estes ainda tem como base as classificações baseadas em características extrínsecas. Muitas espécies forma descritas considerando as características epidemiológicas, ecológicas e biológicas. O atual sistema de classificação propõe a descrição de mais de 30 espécies e tem como base os resultados das análises de isoenzimas "multilocus enzyme electrophoresis", MLEE), técnica essa que ainda é considerada como padrão ouro para identificação de espécies de Leishmania. Alguns estudos empregando um único locus para identificação de Leshmania sugerem a revisão da taxonomia deste gênero. Em um sentido amplo, a análise por um único locus tem sido descrita como análise de código de barras, embora estudos de código de barras "tradicionais" empreguem normalmente o gene mitocondrial citocromo oxidase I - COI. Em todos os estudos de código de barras (sentido amplo), a identificação das espécies Leishmania considera os resultados de MLEE para fins de comparação e nem um destes estudos demonstra total concordância entre as análises de sequência de DNA e os resultados de MLEE, além de algumas discordâncias terem sido detectados entre diferentes análises de DNA No presente estudo analisamos sequências disponíveis no GenBank correspondentes a 19 alvos. Além disso, produzimos 161 sequências para o gene hsp70, totalizando 317 sequências correspondendo a 29 espécies de Leishmania e ainda 255 sequências correspondentes a um fragmento de aproximadamente 500pb de COI, para representantes de 27 espécies. Diferentes níveis de identificação foram obtidos pelos diversos alvos empregados, mas para a maioria das análises os resultados foram comprometidos pelas amostras disponíveis, que não representam todas as espécies, além de limitação devido ao número de isolados por espécie. Este estudo foi suplantado por hsp70 e COI. Alguns autores argumentam que a hsp70 é um bom marcador que pode superar as limitações de MLEE e promover uma boa revisão taxonômica. Os resultados das análises das sequências de hsp70 de muitas espécies de Leishmania e diferentes isolados, por método baseado em distância entre as sequências e agrupamento por NeighborJoining (NJ), indicam algum nível de definição de espécies, mas em alguns casos a delimitação de espécies não foi evidente. Os resultados obtidos com COI indicam uma melhor delimitação de espécies quando comparado com a classificação atual baseada em MLEE O melhor nível de identificação foi visto combinando NJ, com análise de "barcode gaps" que identifica a lacuna entre a distancia intraespecífica e interespecífica e também baseada em caracteres. Algumas espécies descritas não puderam ser identificadas pelo COI e para esses casos sugerimos a complementação com outros alvos. De um modo geral, os resultados apontam para a necessidade de revisão taxonomia de gênero Leishmania, com uma melhor definição das espécies deste grupo de parasitas. No entanto, destacamos o aspecto que os resultados com base em um único locus são apropriados para identificação de espécies, mas não é capaz de promover esta revisão, solicitando uma abordagem de taxonomia integrativa.

Desenvolvimento e avaliação comparativa de metodologias baseadas na PCR para o diagnóstico molecular e identificação específica de agentes etiológicos da leishmaniose tegumentar que circulam em áreas endêmicas brasileiras

A leishmaniose é um complexo de doenças caracterizada não só pelo considerável pleomorfismo clínico, mas também pela variação epidemiológica, devido à notável diversidade de espécies de Leishmania e de vetores envolvidos no ciclo de transmissão e, quando aplicável, os seus grupos de reservatórios. O diagnóstico da infecção por Leishmania associado à identificação da espécie causal é importante para o prognóstico, definição de esquemas terapêuticos adequados e para vigilância epidemiológica da doença. Neste contexto, os métodos baseados na PCR tem sido os mais investigados e por isso muitos métodos tem sido descritos. O principal objetivo deste estudo foi estabelecer uma metodologia que apresentasse uma boa sensibilidade para ser utilizada no diagnóstico da leishmaniose cutânea e que fosse capaz de identificar o agente etiológico causal da infecção ao nível específico. Para isto, neste trabalho utilizamos diferentes metodologias baseadas na PCR que já foram empregadas em vários estudos enfocando o diagnóstico molecular das leishmanioses: PCR kDNA, PCR ITS1 e PCR g6p. O limite de detecção, sensibilidade frente a amostras clínicas obtidas de pacientes com LC e a capacidade destas metodologias em discriminar entre as espécies relacionadas com a LC humana no Brasil foram avaliados. Além disso, considerando resultados anteriores do nosso grupo que indicaram que regiões do gene hsp70 poderiam ser utilizadas para o alcance deste objetivo, desenvolvemos metodologias de PCR direcionadas para a amplificação de fragmentos que correspondiam a distintas regiões do gene hsp70, com tamanho variando entre 230pb a 390pb. Considerando as quatro regiões que foram analisadas, escolhemos uma (aqui denominada de PCR hsp70C) por ter apresentado o melhor limite de detecção de DNA de Leishmania e que, através da PCR RFLP hsp70C, foi capaz de discriminar todas as espécies de Leishmania, patógenos humanos, que circulam no Brasil, quando cepas de referência foram analisadas. A sensibilidade da PCR hsp70C empregando DNA extraído de tecido coletado de pacientes diagnosticados com leishmaniose foi avaliada, comparando com as demais metodologias mencionadas anteriormente; além disso, a capacidade da PCR-RFLP em identificar espécies de Leishmania foi validada empregando um painel de 70 cepas de Leishmania, representando as diferentes espécies e a distribuição geográfica destas, e também foi aplicada ao material clínico analisado. Foi possível concluir que a PCR kDNA é um método bastante sensível e por isso indicado para o diagnóstico molecular das leishmanioses, mas não permite a identificação de espécies. A PCR ITS1 apresenta boa sensibilidade para o diagnóstico das leishmanioses, mas a capacidade de identificação de algumas espécies de Leishmania que circulam nas Américas, através da PCR-RFLP, depende de metodologias mais complexas, dificultando seu uso em áreas de circulação de espécies como L. braziliensis e L. guyanensis, por exemplo. Finalmente, A PCR-RFLP hsp70C, direcionada para a amplificação de uma região do gene hsp70 de Leishmania, combina boa sensibilidade para detectar Leishmania diretamente em material clínico e a habilidade em identificar todas as espécies que circulam no Brasil, sendo útil principalmente em áreas onde existe a ocorrência de espécies de Leishmania em simpatria.

Desenvolvimento e avaliação comparativa de metodologias baseadas na PCR para o diagnóstico molecular e identificação específica de agentes etiológicos da leishmaniose tegumentar que circulam em áreas endêmicas brasileiras / Development and benchmarking of methodologies based on PCR for molecular diagnosis and identification of specific etiologic agents of cutaneous leishmaniasis circulating in Brazilian endemic areas

A leishmaniose é um complexo de doenças caracterizada não só pelo considerável pleomorfismo clínico, mas também pela variação epidemiológica, devido á notável diversidade de espécies de Leishmania e de vetores envolvidos no ciclo de transmissão e, quando aplicável, os seus grupos de reservatórios. O diagnóstico da infecção por Leishmania associado à identificação da espécie causal é importante para o prognóstico, definição de esquemas terapêuticos adequados e para vigilância epidemiológica da doença. Neste contexto, os métodos baseados na PCR tem sido os mais investigados e por isso muitos métodos tem sido descritos. O principal objetivo deste estudo foi estabelecer uma metodologia que apresentasse uma boa sensibilidade para ser utilizada no diagnóstico da leishmaniose cutânea e que fosse capaz de identificar o agente etiológico causal da infecção ao nível específico. Para isto, neste trabalho utilizamos diferentes metodologias baseadas na PCR que já foram empregadas em vários estudos enfocando o dianóstico molecular das leishmanioses: PCR kDNA, PCR ITS1 e PCR g6p. O limite de detecção, sensibilidade frente a amostras clínicas obtidas de pacientes com LC e a capacidade destas metodologias em discriminar entre as espécies relacionadas com a LC humana no Brasil foram avaliados. Além disso, considerando resultados anteriores do nosso grupo que indicaram que regiões do gene hsp70 poderiam ser utilizadas para o alcance deste objetivo, desenvolvemos metodologias de PCR direcionadas para a amplificação de fragmentos que correspondiam a distintas regiões do gene hsp70, com tamanho variando entre 230pb a 390pb. Considerando as quatro regiões que foram analisadas, escolhemos uma (aqui denominada de PCR hsp70C) por ter apresentado o melhor limite de detecção de DNA de Leishmania e que, através da PCR RFLP hsp70C, foi capaz de discriminar todas as espécies de Leishmania, patógenos humanos, que circulam no Brasil, quanco cepas de referência foram analisadas.

A sensibilidade da PCR hsp70C empregando DNA extraído de tecido coletado de pacientes diagnosticados com leishmaniose foi avaliada, comparando com as demais metodologias mencionadas anteriormente; além disso, a capacidade da PCR-RFLP em identificar espécies de Leishmania foi validade empregando um painel de 70 cepas de Leishmania, representando as diferentes espécies e a distribuição geográfica destas, e também foi aplicada ao material clínico analisado. Foi possível concluir que a PCR kDNA é um método bastante sensível e por isso indicado para o diagnóstico molecular das leishmanioses, mas não permite a identificação de espéciesA PCR ITS1 apresenta boa sensibilidade para o diagnóstico das leishmanioses, mas a capacidade de identificação de algumas espécies de Leishmania que circulam nas Américas, através da PCR-RFLP, depende de metodologias mais complexasm dificultando seu uso em áreas de circulação de espécies como L. braziliensis e L. guyanensis, por exemplo. Finalmente, a PCR-RFLP hsp70C, direcionada para a amplificação de uma região do gene hsp70 de Leishmania, combina boa sensibilidade para detectar Leishmania diretamente em material clínico e a habilidade em identificar todas as espécies que circulam no Brasil, sendo útil principalmente em áreas onde existe a ocorrência de espécies de Leishmania em simpatria. (AU)

Desenvolvimento e avaliação comparativa de metodologias baseadas na PCR para o diagnóstico molecular e identificação específica de agentes etiológicos da leishmaniose tegumentar que circulam em áreas endêmicas brasileiras / Development and benchmarking of methodologies based on PCR for molecular diagnosis and identification of specific etiologic agents of cutaneous leishmaniasis circulating in Brazilian endemic areas

A leishmaniose é um complexo de doenças caracterizada não só pelo considerável pleomorfismo clínico, mas também pela variação epidemiológica, devido á notável diversidade de espécies de Leishmania e de vetores envolvidos no ciclo de transmissão e, quando aplicável, os seus grupos de reservatórios. O diagnóstico da infecção por Leishmania associado à identificação da espécie causal é importante para o prognóstico, definição de esquemas terapêuticos adequados e para vigilância epidemiológica da doença. Neste contexto, os métodos baseados na PCR tem sido os mais investigados e por isso muitos métodos tem sido descritos. O principal objetivo deste estudo foi estabelecer uma metodologia que apresentasse uma boa sensibilidade para ser utilizada no diagnóstico da leishmaniose cutânea e que fosse capaz de identificar o agente etiológico causal da infecção ao nível específico. Para isto, neste trabalho utilizamos diferentes metodologias baseadas na PCR que já foram empregadas em vários estudos enfocando o dianóstico molecular das leishmanioses: PCR kDNA, PCR ITS1 e PCR g6p. O limite de detecção, sensibilidade frente a amostras clínicas obtidas de pacientes com LC e a capacidade destas metodologias em discriminar entre as espécies relacionadas com a LC humana no Brasil foram avaliados. Além disso, considerando resultados anteriores do nosso grupo que indicaram que regiões do gene hsp70 poderiam ser utilizadas para o alcance deste objetivo, desenvolvemos metodologias de PCR direcionadas para a amplificação de fragmentos que correspondiam a distintas regiões do gene hsp70, com tamanho variando entre 230pb a 390pb. Considerando as quatro regiões que foram analisadas, escolhemos uma (aqui denominada de PCR hsp70C) por ter apresentado o melhor limite de detecção de DNA de Leishmania e que, através da PCR RFLP hsp70C, foi capaz de discriminar todas as espécies de Leishmania, patógenos humanos, que circulam no Brasil, quanco cepas de referência foram analisadas.

A sensibilidade da PCR hsp70C empregando DNA extraído de tecido coletado de pacientes diagnosticados com leishmaniose foi avaliada, comparando com as demais metodologias mencionadas anteriormente; além disso, a capacidade da PCR-RFLP em identificar espécies de Leishmania foi validade empregando um painel de 70 cepas de Leishmania, representando as diferentes espécies e a distribuição geográfica destas, e também foi aplicada ao material clínico analisado. Foi possível concluir que a PCR kDNA é um método bastante sensível e por isso indicado para o diagnóstico molecular das leishmanioses, mas não permite a identificação de espéciesA PCR ITS1 apresenta boa sensibilidade para o diagnóstico das leishmanioses, mas a capacidade de identificação de algumas espécies de Leishmania que circulam nas Américas, através da PCR-RFLP, depende de metodologias mais complexasm dificultando seu uso em áreas de circulação de espécies como L. braziliensis e L. guyanensis, por exemplo. Finalmente, a PCR-RFLP hsp70C, direcionada para a amplificação de uma região do gene hsp70 de Leishmania, combina boa sensibilidade para detectar Leishmania diretamente em material clínico e a habilidade em identificar todas as espécies que circulam no Brasil, sendo útil principalmente em áreas onde existe a ocorrência de espécies de Leishmania em simpatria. (AU)

Desenvolvimento e avaliação comparativa de metodologias baseadas na PCR para o diagnóstico molecular e identificação específica de agentes etiológicos da leishmaniose tegumentar que circulam em áreas endêmicas brasileiras / Development and benchmarking of methodologies based on PCR for molecular diagnosis and identification of specific etiologic agents of cutaneous leishmaniasis circulating in Brazilian endemic areas

A leishmaniose é um complexo de doenças caracterizada não só pelo considerável pleomorfismo clínico, mas também pela variação epidemiológica, devido á notável diversidade de espécies de Leishmania e de vetores envolvidos no ciclo de transmissão e, quando aplicável, os seus grupos de reservatórios. O diagnóstico da infecção por Leishmania associado à identificação da espécie causal é importante para o prognóstico, definição de esquemas terapêuticos adequados e para vigilância epidemiológica da doença. Neste contexto, os métodos baseados na PCR tem sido os mais investigados e por isso muitos métodos tem sido descritos. O principal objetivo deste estudo foi estabelecer uma metodologia que apresentasse uma boa sensibilidade para ser utilizada no diagnóstico da leishmaniose cutânea e que fosse capaz de identificar o agente etiológico causal da infecção ao nível específico. Para isto, neste trabalho utilizamos diferentes metodologias baseadas na PCR que já foram empregadas em vários estudos enfocando o dianóstico molecular das leishmanioses: PCR kDNA, PCR ITS1 e PCR g6p. O limite de detecção, sensibilidade frente a amostras clínicas obtidas de pacientes com LC e a capacidade destas metodologias em discriminar entre as espécies relacionadas com a LC humana no Brasil foram avaliados. Além disso, considerando resultados anteriores do nosso grupo que indicaram que regiões do gene hsp70 poderiam ser utilizadas para o alcance deste objetivo, desenvolvemos metodologias de PCR direcionadas para a amplificação de fragmentos que correspondiam a distintas regiões do gene hsp70, com tamanho variando entre 230pb a 390pb. Considerando as quatro regiões que foram analisadas, escolhemos uma (aqui denominada de PCR hsp70C) por ter apresentado o melhor limite de detecção de DNA de Leishmania e que, através da PCR RFLP hsp70C, foi capaz de discriminar todas as espécies de Leishmania, patógenos humanos, que circulam no Brasil, quanco cepas de referência foram analisadas. A sensibilidade da PCR hsp70C empregando DNA extraído de tecido coletado de pacientes diagnosticados com leishmaniose foi avaliada, comparando com as demais metodologias mencionadas anteriormente; além disso, a capacidade da PCR-RFLP em identificar espécies de Leishmania foi validade empregando um painel de 70 cepas de Leishmania, representando as diferentes espécies e a distribuição geográfica destas, e também foi aplicada ao material clínico analisado. Foi possível concluir que a PCR kDNA é um método bastante sensível e por isso indicado para o diagnóstico molecular das leishmanioses, mas não permite a identificação de espéciesA PCR ITS1 apresenta boa sensibilidade para o diagnóstico das leishmanioses, mas a capacidade de identificação de algumas espécies de Leishmania que circulam nas Américas, através da PCR-RFLP, depende de metodologias mais complexasm dificultando seu uso em áreas de circulação de espécies como L. braziliensis e L. guyanensis, por exemplo. Finalmente, a PCR-RFLP hsp70C, direcionada para a amplificação de uma região do gene hsp70 de Leishmania, combina boa sensibilidade para detectar Leishmania diretamente em material clínico e a habilidade em identificar todas as espécies que circulam no Brasil, sendo útil principalmente em áreas onde existe a ocorrência de espécies de Leishmania em simpatria.