RESUMO
O gene correspondente à PsaA madura do serotipo 14 de Streptococcus pneumoniae foi clonado em um plasmídeo com resistência à canamicina e sem um marcador de purificação em Escherichia coli para expressar altos níveis da proteína recombinante para produção em larga escala como potencial candidato a vacina ou como transportador para conjugação de polissacarídeos em Bio-Manguinhos / Fiocruz. A avaliação das condições de indução (concentração de IPTG, temperatura e tempo) em E. coli foi realizada por técnicas de planejamento experimental para aumentar o nível de expressão de PsaA recombinante madura (rPsaA). A otimização das condições do processo de indução nos levou a realizar a indução da proteína recombinante a 25 ° C por 16 h, com 0,1 mM IPTG em meio de caldo Terrific. Nestas condições, o nível de expressão de rPsaA madura obtido em E. coli BL21 (DE3) Star por indução pET28a com IPTG estava na faixa de 0,8 g / L de meio de cultura, com uma concentração 10 vezes menor de indutor do que usualmente empregado , o que contribui para um processo menos dispendioso. O rPsaA maduro expresso em E. coli BL21 (DE3) Star representou aproximadamente 30-35% da proteína total. A purificao de rPsaA por troca iica permitiu a produo de protea recombinante de alta pureza sem etiquetas de fus. Os resultados apresentados neste trabalho confirmam que a proteína recombinante purificada mantém sua estabilidade e integridade por longos períodos de tempo em várias condições de armazenamento (temperaturas de 4 ou -70 ° C usando diferentes crioprotetores) e por pelo menos 3 anos a 4 ou −70 ° C em PBS. A conformação da proteína armazenada foi confirmada usando dicroísmo circular. A antigenicidade rPsaA madura foi comprovada pelo reconhecimento de soro de ratinho anti-rPsaA através de análise de western blot, e não foi detectada degradação de proteína após longos períodos de armazenamento.
Assuntos
Projetos de Pesquisa , Estabilidade ProteicaRESUMO
Apresenta-se neste trabalho a situaçäo da vacinaçäo, produçäo e desenvolvimento tecnológico de vacinas no mundo e no Brasil; também säo feitas algumas reflexöes sobre a complexidade da inovaçäo tecnológica de vacinas e as diversas etapas do processo de desenvolvimento tecnológico requeridas para esse completo desenvolvimento. Descrevem-se várias etapas envolvidas, com análise dos parâmetros e fatores integrantes em cada etapa, os requisitos técnicos de instalaçöes e equipamentos, as normas de boas práticas de fabricaçäo(BPF_), a necessidade organizacional, de infra-estrutura e de gestäo, o longo período e o alto custo demandados para essa atividade.