RESUMO
Over the past few years, an increasing number of long noncoding RNAs (lncRNAs) have been identified in mammalian genomes. Most of these lncRNAs are expressed at low levels in different human cell types. lncRNAs are found not only in the nucleus but are also enriched in the cytosolic fraction and are associated with translating polysomes. Expression of lncRNAs that have putative roles in cell differentiation has been identified in embryonic and adult stem cells. Nevertheless, the mechanisms by which lncRNAs operate in the cell are still poorly understood.Here, we studied the expression of the subpopulation of lncRNAs that are associated with polysomes in adipose-derived stem cells (hASCs) during their commitment to adipocytes. We established that lncRNAs and protein coding genes have similar expression levels. The relatively comparable expression of these transcripts could be a particular feature of hASCs. We then show that lncRNAs are associated with polysomes in undifferentiated and early differentiating cells, which was confirmed by quantitative RT-PCR. The association of lncRNAs with polysomes was also comparable to that of mRNAs. Our results suggest that the presence of lncRNAs in the polysomal RNA fraction is not the result of random association. We observed that a high percentage of lncRNAs are actively mobilized to or from polysomes during early stages of adipogenesis. Moreover, we found several lncRNAs that can potentially target miRNAs relevant to adipogenesis.
Assuntos
Tecido Adiposo/citologia , Polirribossomos/metabolismo , RNA Longo não Codificante/metabolismo , Células-Tronco/citologia , Transcriptoma , Adipogenia , Tecido Adiposo/metabolismo , Técnicas de Cultura de Células , Separação Celular , Humanos , Biossíntese de Proteínas , Proteínas/genética , RNA Longo não Codificante/genética , Células-Tronco/metabolismoRESUMO
Commitment of adult stem cells involves the activation of specific gene networks regulated from transcription to protein synthesis. Here, we used ribosome profiling to identify mRNAs regulated at the translational level, through both differential association to polysomes and modulation of their translational rates. We observed that translational regulation during the differentiation of human adipose-derived stromal cells (hASCs, also known as adipose-derived mesenchymal stem cells), a subset of which are stem cells, to adipocytes was a major regulatory event. hASCs showed a significant reduction of whole protein synthesis after adipogenic induction and a downregulation of the expression and translational efficiency of ribosomal proteins. Additionally, focal adhesion and cytoskeletal proteins were downregulated at the translational level. This negative regulation of the essential biological functions of hASCs resulted in a reduction in cell size and the potential of hASCs to migrate. We analyzed whether the inactivation of key translation initiation factors was involved in this observed major repression of translation. We showed that there was an increase in the hypo phosphorylated forms of 4E-BP1, a negative regulator of translation, during early adipogenesis. Our results showed that extensive translational regulation occurred during the early stage of the adipogenic differentiation of hASCs.
Assuntos
Adipócitos/metabolismo , Adipogenia , Células-Tronco Mesenquimais/metabolismo , Biossíntese de Proteínas , Células Estromais/metabolismo , Proteínas Adaptadoras de Transdução de Sinal/genética , Proteínas Adaptadoras de Transdução de Sinal/metabolismo , Adipócitos/citologia , Proteínas de Ciclo Celular , Regulação para Baixo , Regulação da Expressão Gênica , Humanos , Células-Tronco Mesenquimais/citologia , Fosfoproteínas/genética , Fosfoproteínas/metabolismo , Células Estromais/citologiaRESUMO
MicroRNAs são pequenas moléculas de RNA (~ 22 nucleotídeos), que atuam como reguladores pós-transcricional da expressão de genes, inibindo a tradução do RNA mensageiro. MicroRNAs estão envolvidos na regulação de muitos processos biológicos e patológicos, assim como a via de sinalização Hedgehog (Hh). Nós avaliamos a expressão de quatro microRNAs (miR-20a, miR-31, miR-17 e miR-199b5p) em células-tronco derivadas de tecido adiposo humano sob ativação e bloqueio da via de sinalização Hh. As células foram tratadas com purmorfamina (ativador da via Hh) ou ciclopamina (bloqueador da via Hh) durante 24 horas. Extração de RNA e cDNA foram realizadas para fazer a analise da expressão dos miRNAs por RT-PCR quantitativa. O nível de expressão do miR-20a e miR-31 aumentou após o bloqueio da via de sinalização Hh, sendo assim, esses miRNAs podem estar envolvidos no controle da proliferação de células-tronco e câncer. O miR-20a e o miR-31 são fortes candidatos para biomarcadores da via Hh.
RESUMO
Células-tronco (CT) são células autorrenováveis e não especializadas, com o potencial de diferenciação multidirecional. Células-tronco de tecido adiposo (CT-TA) são um tipo de células-tronco adultas multipotentes, de fácil isolamento e cultura. Nos últimos anos, CT-TA têm mostrado grande potencial para engenharia de tecidos e terapias baseadas em células. Apesar do interesse em aplicações clínicas deste tipo de célula, os mecanismos moleculares fundamentais a sua autorrenovação e diferenciação ainda não foram completamente elucidados. miRNAs são pequenos RNAs não-codificadores, com 21-25 nucleotídeos de comprimento, que tem se mostrado como importantes reguladores da expressão gênica em nível pós-transcricional. miRNAs podem atuar por meio de clivagem direta de mRNAs alvo ou através da repressão da tradução, dependendo da complementaridade entre o mRNA e a sequência do miRNA. Perfis de miRNAs de CT adultas sugerem que estes pequenos reguladores podem contribuir para as propriedades intrínsecas das CT. Para entender melhor os mecanismos de ação dos miRNAs em CT-TA, miRNAs associados ao polissomos de CT-TA foram isolados durante a diferenciação celular. Procurando miRNAs reguladores das etapas iniciais de diferenciação ou envolvidos na autorrenovação de CT, as culturas de células foram induzidas a diferenciação adipogênica durante 72 h. O lisado celular foi submetido à ultracentrifugação em gradiente de sacarose para separar monosomos, polissomos e fração livre de ribossomos. O RNA total associado aos ribossomos foi extraído, os fragmentos de RNA (<200 nt) foram enriquecidos e a seleção de tamanho de fragmentos de RNA apropriados ocorreu durante a preparação das amostras para o sequenciamento em larga escala. As amostras foram sequenciadas utilizando a plataforma SOLiD ™, e as frações polissomais de culturas Não Induzida e 72h de indução foram comparadas e dezesseis miRNAs foram identificados. miRNAs encontrados em um trabalho prévio do grupo foram adicionados a esses dados, e sete miRNAs (hsamiR-29b-1-5p, hsa- miR-29c-5, hsa-miR-30c-5p, hsa-miR-143-5p, hsa-miR-210-3p, hsa-miR-210- 5p e hsa-miR-6775- 5p) foram testados por RT-qPCR para confirmar a expressão diferencial, sendo que um deles (hsa-miR-210-5p) mostrou diferença estatisticamente significativa.