RESUMO
BACKGROUND: The Yellow Fever (YF) vaccine is produced by the inoculation of embryonated chicken eggs with YF17DD virus on the ninth day of development. Full embryos are collected on the twelfth day of development for vaccine formulation. Skeletal muscle tissue is the main site where biosynthesis of viral particles occurs. OBJECTIVES: This study aimed to analyse the experimental infection of skeletal muscle cells of chicken embryos by the 17DD Yellow Fever virus (YFV) in vivo and in vitro. METHODS: Chicken embryos infected with YF17DD virus were analysed by immunofluorescence using confocal and super-resolution microscopes. Primary cultures of skeletal muscle cells of non-infected chicken embryos were evaluated for susceptibility and permissiveness to YF17DD virus using different protocols. This evaluation was performed based on morphological, viral titration, molecular biology, and colorimetric techniques. FINDINGS: The present work phenotypically characterises embryonic chicken skeletal muscle cells as myogenic precursors expressing the Pax7 transcription factor in some cases. We demonstrated that these cells are susceptible to in vitro infection at different multiplicities of infection (MOIs), reproducing the same infection pattern observed in vivo. Furthermore, myogenic precursors and myoblasts are preferred infection targets, but establishment of infection does not depend on the presence of these cells. The peak of viral production occurred at 48 hpi, with decay occurring 72 hpi, when the cytopathic effect can be observed. MAIN CONCLUSIONS: In conclusion, the primary culture of chicken skeletal muscle cells is a good model for studying muscle cells infected with YF17DD virus. This culture system displays satisfactory emulation of the in vitro phenomenon observed, contributing to our understanding of virus infection dynamics and leading to the development of alternative methods of vaccine production.
Assuntos
Músculo Esquelético/virologia , Vacina contra Febre Amarela/imunologia , Vírus da Febre Amarela/imunologia , Animais , Células Cultivadas , Embrião de Galinha , Imunofluorescência , Cultura de Vírus , Replicação Viral/fisiologia , Vacina contra Febre Amarela/biossíntese , Vírus da Febre Amarela/crescimento & desenvolvimentoRESUMO
Despite toxoplasmosis being a common infection among human and other warm-blooded animals worldwide, there are no findings about Toxoplasma gondii evolutionary forms in ancient populations. The molecular techniques used for amplification of genetic material have allowed recovery of ancient DNA (aDNA) from parasites contained in mummified tissues. The application of polymerase chain reaction (PCR) to paleoparasitological toxoplasmosis research becomes a promising option, since it might allow diagnosis, acquisition of paleoepidemiological data, access to toxoplasmosis information related origin, evolution, and distribution among the ancient populations. Furthermore, it makes possible the analysis of parasite aDNA aiming at phylogenetic studies. To standardize and evaluate PCR applicability to toxoplasmosis paleodiagnostic, an experimental mummification protocol was tested using desiccated tissues from mice infected with the ME49 strain cysts, the chronic infection group (CIG), or infected with tachyzoites (RH strain), the acute infection group (AIG). Tissues were subjected to DNA extraction followed by PCR amplification of T. gondii B1 gene. PCR recovered T. gondii DNA in thigh muscle, encephalon, heart, and lung samples. AIG presented PCR positivity in encephalon, lungs, hearts, and livers. Based on this results, we propose this molecular approach for toxoplasmosis research in past populations.
Assuntos
DNA de Protozoário/isolamento & purificação , Dissecação , Reação em Cadeia da Polimerase/métodos , Toxoplasma/isolamento & purificação , Animais , DNA de Protozoário/análise , Feminino , Técnicas Imunoenzimáticas , Camundongos , Camundongos Endogâmicos C57BL , Toxoplasma/genéticaRESUMO
Despite toxoplasmosis being a common infection among human and other warm-blooded animals worldwide, there are no findings about Toxoplasma gondii evolutionary forms in ancient populations. The molecular techniques used for amplification of genetic material have allowed recovery of ancient DNA (aDNA) from parasites contained in mummified tissues. The application of polymerase chain reaction (PCR) to paleoparasitological toxoplasmosis research becomes a promising option, since it might allow diagnosis, acquisition of paleoepidemiological data, access to toxoplasmosis information related origin, evolution, and distribution among the ancient populations.Furthermore, it makes possible the analysis of parasite aDNA aiming at phylogenetic studies. To standardize and evaluate PCR applicability to toxoplasmosis paleodiagnostic, an experimental mummification protocol was tested using desiccated tissues from mice infected with the ME49 strain cysts, the chronic infection group (CIG), or infected with tachyzoites (RH strain), the acute infection group (AIG). Tissues were subjected to DNA extraction followed by PCR amplification of T. gondii B1 gene. PCR recovered T. gondii DNA in thigh muscle, encephalon, heart, and lung samples. AIG presented PCR positivity in encephalon, lungs, hearts, and livers. Based on this results, we propose this molecular approach for toxoplasmosis research in past populations.
Assuntos
Animais , Feminino , Camundongos , Dissecação , DNA de Protozoário , Reação em Cadeia da Polimerase , Toxoplasma , DNA de Protozoário , Técnicas Imunoenzimáticas , Camundongos Endogâmicos C57BL , ToxoplasmaRESUMO
A despeito da ampla distribuição mundial da toxoplasmose entre diversas espécies de hospedeiros, não há relatos do achado de formas evolutivas de seu agente etiológico, o Toxoplasma gondii, em material de origem arqueológica. A aplicação da Reação em Cadeia da Polimerase (PCR) a este estudo torna-se uma opção bastante promissora, pois, através da amplificação do DNA antigo (aDNA) do parasito, permite não apenas o diagnóstico, como também a obtenção de dados paleoepidemiológicos, favorecendo o acesso a informações relacionadas à origem, evolução e distribuição da toxoplasmose entre as populações antigas, além de viabilizar a análise do aDNA parasitário visando aos estudos filogenéticos. A fim de padronizar e avaliar a aplicabilidade da PCR ao paleodiagnóstico desta infecção, este trabalho testou um protocolo de mumificação experimental, no qual foram usados dez camundongos da linhagem C57Black/6: quatro infectados intraperitonialmente com 10 cistos teciduais da cepa ME49 de Toxoplasma gondii (grupo de infecção crônica-GIC), outros quatro inoculados com 1x 104 taquizoítos da cepa RH (grupo de infecção aguda-GIA) e 2 não infectados por T. gondii (grupo controle negativo-GCN). Após 45 dias de infecção para GIC e 3 dias para o GIA, os animais foram sacrificados, coletadas amostras de sangue para a pesquisa de IgG anti-toxoplasma pela Reação de Imunofluorescência Indireta (RIFI) e retirados encéfalo, coração, fígado, pulmão e musculatura da coxa, sofrendo dessecação experimental em estufa clínica a 39oC por 45 dias. As peças foram tratadas para a extração de DNA e submetidos à amplificação de seqüências do gene B1 de T. gondii pela PCR. Paralelamente, realizou-se um estudo imuno-histoquímico pela técnica da avidina-peroxidase, para o mapeamento parasitário em cortes teciduais de camundongos infectados. Resultados da RIFI confirmaram a infecção de todos os animais do GIC. A PCR recuperou DNA de T. gondii em 15/20 amostras do GIC e em 10/20 do GIA. No GIC, observou-se alta positividade pela PCR na musculatura de coxas, encéfalos, corações e pulmões, entretanto, a técnica da avidina-peroxidase apontou maior prevalência apenas em encéfalos.O GIA obteve maior positividade pela PCR em pulmões, corações e fígados, concordando com os resultados do estudo imuno-histoquímico. Com base nestes resultados, propomos a utilização desta abordagem molecular na pesquisa da toxoplasmose em populações do passado.(AU)