Proteoma urinario en la enfermedad renal diabética. Estado del arte

La enfermedad renal diabética (ERD) es la principal complicación microvascular de los pacientes con diabetes mellitus; esta es una entidad que genera un aumento significativo en la mortalidad de origen cardiovascular de este grupo de pacientes, aunque su diagnóstico temprano impacta de forma significativa en la evolución a enfermedad renal terminal y, por lo tanto, en la mortalidad. La detección de albuminuria en la orina y el deterioro de la tasa de filtración glomerular estimada son las principales técnicas diagnósticas que se utilizan en la práctica clínica para establecer la presencia de ERD; sin embargo, estas tienen limitaciones y por lo tanto es importante resaltar que el daño renal suele ser irreversible una vez están presentes. Durante los últimos años, numerosos estudios se han enfocado en detectar nuevos biomarcadores para detectar ERD y es aquí donde aparece como nueva herramienta la proteómica urinaria, una tecnología emergente que permite identificar en una muestra de orina proteínas que sugieren la presencia de esta enfermedad de manera temprana. Asimismo, el descubrimiento de biomarcadores basados en proteómicos representa una estrategia novedosa para mejorar el diagnóstico, pronóstico y tratamiento de la nefropatía diabética; sin embargo, los enfoques basados en la proteómica aún no están disponibles en la mayoría de los laboratorios de química clínica.

Diabetic kidney disease (DKD) is the main microvascular complication in patients with diabetes mellitus; it is an entity that generates a significant increase in mortality of cardiovascular origin in this group of patients, although its early diagnosis has a significant impact on the evolution to end-stage kidney disease and, therefore, on mortality. The detection of albuminuria in urine and the deterioration of the estimated glomerular filtration rate are the main diagnostic techniques that are used in clinical practice to establish the presence of DKD; however, they have limitations and therefore it is important to note that kidney damage is usually irreversible once they are present. Over the last few years, numerous studies have focused on the discovery of new biomarkers to detect DKD and this is where the urinary proteomics appears as a new tool, an emerging technology that allows the identification of proteins in a urine sample that strongly suggest the early presence of this disease. Likewise, the discovery of proteomic-based biomarkers represents a novel strategy to improve the diagnosis, prognosis and treatment of diabetic nephropathy; however, proteomics-based approaches are not yet available in the majority of clinical chemistry laboratories.

Alterações sistêmicas na assinatura do ciclo celular de pacientes com COVID-19 / Systemic changes in the cell cycle signature of patients with COVID-19

Com base nas perturbações fosfoproteômicas de moléculas associadas ao ciclo celular em células infectadas pelo coronavírus causador da síndrome respiratória aguda grave (SARSCoV)-2, a hipótese de inibidores do ciclo celular como uma terapia potencial para a doença de coronavírus 2019 (COVID-19) foi proposta. No entanto, o cenário das alterações do ciclo celular em COVID-19 permanece inexplorado. Aqui, realizamos uma análise integrativa de sistemas imunológicos de proteoma publicamente disponível (espectrometria de massa) e dados de transcriptoma (sequenciamento de RNA em massa e de célula única [scRNAseq]), com o objetivo de caracterizar mudanças globais na assinatura do ciclo celular de pacientes com COVID-19. Além de módulos de co-expressão de genes significativos enriquecidos associados ao ciclo celular, encontramos uma rede interconectada de proteínas diferencialmente expressas associadas ao ciclo celular (DEPs) e genes (DEGs) integrando dados moleculares de 1.480 indivíduos (974 pacientes infectados por SARS-CoV-2 e 506 controles [controles saudáveis ou indivíduos com outras doenças respiratórias]). Entre esses DEPs e DEGs estão várias ciclinas (CCNs), ciclo de divisão celular (CDCs), quinases dependentes de ciclinas (CDKs) e proteínas de manutenção de minicromossomos (MCMs). Embora os pacientes com COVID-19 compartilhem parcialmente o padrão de expressão de algumas moléculas associadas ao ciclo celular com outras doenças respiratórias, eles exibiram uma expressão significativamente maior de moléculas associadas ao ciclo celular relacionadas à gravidade da doença. Notavelmente, a assinatura do ciclo celular predominou nos leucócitos do sangue dos pacientes, mas não nas vias aéreas superiores. Os dados de scRNAseq de 229 indivíduos (159 pacientes com COVID- 19 e 70 controles) revelaram que as alterações das assinaturas do ciclo celular predominam nas células B, T e NK. Esses resultados fornecem uma compreensão global única das alterações nas moléculas associadas ao ciclo celular em pacientes com COVID-19, sugerindo novas vias putativas para intervenção terapêutica

Based on phosphoproteomics perturbations of cell cycle-associated molecules in severe acute respiratory syndrome coronavirus (SARS-CoV)-2-infected cells, the hypothesis of cell cycle inhibitors as a potential therapy for Coronavirus disease 2019 (COVID-19) has been proposed. However, the landscape of cell cycle alterations in COVID-19 remains mostly unexplored. Here, we performed an integrative systems immunology analysis of publicly available proteome (mass spectrometry) and transcriptome data (bulk and single-cell RNA sequencing [scRNAseq]), aiming to characterize global changes in the cell cycle signature of COVID-19 patients. Beyond significant enriched cell cycle-associated gene co-expression modules, we found an interconnected network of cell cycle-associated differentially expressed proteins (DEPs) and genes (DEGs) by integrating molecular data of 1,480 individuals (974 SARS-CoV- 2 infected patients and 506 controls [either healthy controls or individuals with other respiratory illness]). Among these DEPs and DEGs are several cyclins (CCNs), cell division cycle (CDCs), cyclin-dependent kinases (CDKs), and mini-chromosome maintenance proteins (MCMs). Although COVID-19 patients partially shared the expression pattern of some cell cycleassociated molecules with other respiratory illnesses, they exhibited a significantly higher expression of cell cycle-associated molecules associated with disease severity. Notably, the cell cycle signature predominated in the patients blood leukocytes but not in the upper airways. The scRNAseq data from 229 individuals (159 COVID-19 patients and 70 controls) revealed that the alterations of cell cycle signatures predominate in B, T, and NK cells. These results provide a unique global comprehension of the alterations in cell cycle-associated molecules in COVID-19 patients, suggesting new putative pathways for therapeutic intervention

Caracterización molecular de bacterias patógenas de las vías respiratorias de pacientes peruanos con fibrosis quística / Molecular characterization of pathogenic bacteria of the respiratory tract in peruvian patients with cystic fibrosis

RESUMEN Objetivos. Caracterizar a nivel molecular las bacterias patógenas de las vías respiratorias de pacientes peruanos con fibrosis quística (FQ). Materiales y métodos. Se caracterizaron las comunidades bacterianas cultivables a partir de muestras de esputo de pacientes pediátricos y adultos con FQ registrados en el Hospital Nacional Edgardo Rebagliati Martins y el Instituto Nacional de Salud del Niño (INSN). Para el cultivo bacteriano se utilizaron técnicas microbiológicas estándares, y para la caracterización molecular la secuenciación del gen ARNr 16S y espectrometría de masas de tipo desorción/ionización con láser asistido por matriz con tiempo de vuelo (MALDI TOF) y MALDI TOF/TOF. Resultados. Por secuenciación del ARNr 16S se identificaron 127 cepas, encontrando las bacterias patógenas Pseudomonas aeruginosa (31,5%), Staphylococcus aureus (12,6%), Pseudomonas spp. (11,8%), Klebsiella oxytoca (3,1%), otras especies mostraron baja prevalencia. El análisis por MALDI TOF permitió obtener una serie de espectros representativos de cada especie aislada, mientras que el análisis por MALDI TOF/TOF reveló péptidos y proteínas de las especies más comunes con informaciones complementarias que revelarían datos sobre su patogenicidad o sensibilidad a antibióticos. Conclusiones. Los principales microorganismos patógenos encontrados en las vías respiratorias son similares a los reportados en otros países. Estos son los primeros hallazgos en Perú que muestran la caracterización bacteriana por secuenciación del ARNr 16S, por MALDI TOF y MALDI TOF TOF. Los hallazgos permiten la identificación bacteriana de microorganismos nativos relacionados con la FQ basada en el análisis de su proteoma.

ABSTRACT Objectives. To molecularly characterize the pathogenic bacteria of the respiratory tract isolated from patients with cystic fibrosis (CF) in Peru. Materials and methods. Bacterial communities cultured from sputum samples of pediatric and adult patients with CF admitted to the Edgardo Rebagliati Martins National Hospital and the National Institute of Child Health were characterized. Standard microbiological techniques were used for bacterial culture, and gene sequencing of 16S rRNA and matrix-assisted laser desorption ionization time-of-flight (MALDI-TOF) mass spectrometry and tandem MALDI-TOF mass spectrometry (MALDI TOF/TOF) were used for molecular characterization. Results. Seventeen bacterial strains were characterized by 16S rRNA sequencing, and the identified pathogenic bacteria were Pseudomonas aeruginosa (31.5%), Staphylococcus aureus (12.6%), Pseudomonas spp. (11.8%), and Klebsiella oxytoca (3.1%). MALDI-TOF analysis generated a series of spectra representative of each isolated bacterial species, whereas MALDI TOF/TOF analysis identified the peptides and proteins of the most common strains and provided data on pathogenicity and sensitivity to antibiotics. Conclusions. The primary pathogenic microorganisms found in the respiratory tract of patients with CF in Peru were the same as those found in other countries. This study is the first to perform 16S rRNA sequencing as well as MALDI-TOF and MALDI-TOF/TOF analysis of the bacterial pathogens circulating in Peru. The inclusion of proteomic analysis further allowed for the identification of native microorganisms involved in CF.

Proteomic analysis of saffron (Crocus sativus L. ) grown under conditions of cadmium toxicity / Análise proteômica do açafrão (Crocus sativus L. ) cultivado sob condições de toxicidade por cádmio

Cd is a highly detrimental global environmental pollutant. Plants have evolved complex defense mechanisms as an adaptation to against Cd toxicity. In this study, a pot experiment was performed to evaluate the protein profile of saffron in response to Cd stress. Fifteen proteins were found to be up-regulated in the leaves of plants under Cd stress and were primarily related to metabolism, signal transduction, stress and defense response and energy. Eleven proteins were found to be down-regulated following Cd treatment, including ribulose bisphosphate carboxylase/oxygenase (Rubisco), ferredoxin-NADP reductase, a 70 kDa heat shock-related protein and three protein synthesis-associated proteins. The results provide valuable insights regarding the molecular mechanism of saffron in response to Cd toxicity and the possible utilization of genetic resources in developing Cd tolerant/low-accumulation saffron.

O cádmio (Cd) é um poluente ambiental global altamente prejudicial. As plantas desenvolveram mecanismos de defesa complexos como uma adaptação contra a toxicidade por Cd. Neste estudo, realizou-se um experimento em vaso para avaliar o perfil proteico do açafrão em resposta ao estresse por Cd. Foi descoberto que quinze proteínas foram supra-reguladas (up-regulated) nas folhas de plantas sob estresse por Cd e foram principalmente relacionados ao metabolismo, transdução de sinal, estresse e resposta de defesa e energia. Foi descoberto ainda que onze proteínas foram infra-reguladas (down-regulated) após tratamento com Cd, incluindo ribulose bifosfato carboxilase oxigenase (RuBisCO), ferredoxina-NADP redutase, uma proteína relacionada com o choque térmico de 70 kDa e três proteínas associadas à síntese de proteínas. Os resultados fornecem informações valiosas sobre o mecanismo molecular do açafrão em resposta à toxicidade do Cd e a possível utilização de recursos genéticos no desenvolvimento de açafrão tolerante ao Cd e de baixa acumulação.

Mitochondrial proteomic profile of complex IV deficiency fibroblasts: rearrangement of oxidative phosphorylation complex/supercomplex and other metabolic pathways / Perfil proteómico mitocondrial de los fibroblastos con deficiencia del complejo IV: reordenamiento del complejo/supercomplejo de la fosforilación oxidativa y otras vías metabólicas

Abstract: Background: Mitochondriopathies are multisystem diseases affecting the oxidative phosphorylation (OXPHOS) system. Skin fibroblasts are a good model for the study of these diseases. Fibroblasts with a complex IV mitochondriopathy were used to determine the molecular mechanism and the main affected functions in this disease. Methods: Skin fibroblast were grown to assure disease phenotype. Mitochondria were isolated from these cells and their proteome extracted for protein identification. Identified proteins were validated with the MitoMiner database. Results: Disease phenotype was corroborated on skin fibroblasts, which presented a complex IV defect. The mitochondrial proteome of these cells showed that the most affected proteins belonged to the OXPHOS system, mainly to the complexes that form supercomplexes or respirosomes (I, III, IV, and V). Defects in complex IV seemed to be due to assembly issues, which might prevent supercomplexes formation and efficient substrate channeling. It was also found that this mitochondriopathy affects other processes that are related to DNA genetic information flow (replication, transcription, and translation) as well as beta oxidation and tricarboxylic acid cycle. Conclusions: These data, as a whole, could be used for the better stratification of these diseases, as well as to optimize management and treatment options.

Resumen: Introducción: Las mitocondriopatías son enfermedades multisistémicas que afectan el funcionamiento de la fosforilación oxidativa (OXPHOS). Un buen modelo de estudio para estas enfermedades es el cultivo primario de fibroblastos. En este trabajo se utilizaron fibroblastos con mitocondriopatía del complejo IV para determinar cuáles son las principales funciones afectadas en esta enfermedad. Métodos: Se realizaron cultivos primarios de fibroblastos para corroborar el fenotipo de la enfermedad. Las mitocondrias se aislaron de estas células y se extrajo su proteoma para su identificación. Las proteínas identificadas se validaron con la base de datos de MitoMiner. Resultados: Los fibroblastos conservaron el fenotipo de la enfermedad que incluye un defecto del complejo IV. El proteoma mitocondrial de estas células mostró que las proteínas más afectadas pertenecen al sistema de OXPHOS, principalmente los complejos que forman supercomplejos o respirosomas (I, III, IV y V). El defecto en el complejo IV al parecer se debió a problemas de ensamblaje que pueden evitar la formación de los supercomplejos y la eficiente canalización de sustratos. También se observó que esta mitocondriopatía afecta otros procesos relacionados con el flujo de información genética del DNA (replicación, transcripción y traducción), así como con la beta oxidación y el ciclo de los ácidos tricarboxílicos (TCA). Conclusiones: En conjunto, estos datos podrían utilizarse para una mejor clasificación de estas enfermedades, así como para la optimización de las opciones de manejo y tratamiento.

Considerations about gastric cancer proteomics / Considerações sobre proteômica no câncer gástrico

A frequência de estudos moleculares visando a analisar os promotores de metilação de genes supressores de tumor e proteômica globais na carcinogênese gástrica está aumentando. No entanto, apenas alguns consideraram os diferentes tipos de células do estômago, a localização do tumor e a influência da infecção por Helicobacter pylori e pelo vírus Epstein-Barr (EBV). Diferenças moleculares relacionadas com áreas tumorais anatômicas e histológicas também foram recentemente descritas. Os autores propõem uma classificação molecular de câncer gástrico, dividindo-o em quatro subtipos: tumores positivos para o EBV; tumores microssatélite instáveis; tumores genomicamente estáveis e tumores com instabilidade cromossômica.

Caracterização de proteínas e antígenos nas diferentes fases do ciclo biológico do fungo Histoplasma capsulatum

Histoplasma capsulatum var. capsulatum é o agente etiológico da histoplasmose clássica, uma importante micose sistêmica, com distribuição cosmopolita e predomínio nas Américas. Histoplasma capsulatum é um fungo dimórfico, podendo se apresentar nas fases de micélio ou levedura. O dimorfismo é uma característica importante para sobrevivência fúngica em diferentes ambientes e tem sido relacionado com a virulência de H. capsulatum. Consequentemente, sua patogenicidade é frequentemente associada à transição dimórfica. Perfis proteômicos têm trazido importantes contribuições ao conhecimento do metabolismo e patogenicidade em vários modelos biológicos. No entanto, estudos do proteoma de H. capsulatum e a caracterização de prováveis proteínas antigênicas participantes tanto da resposta celular como humoral do hospedeiro têm sido ainda pouco explorados. No presente estudo, foi utilizada a cromatografia líquida acoplada à espectrometria de massas para avaliar o perfil proteômico das fases de levedura e micélio de H. capsulatum (G217B - ATCC 26032). Foram identificadas 696 proteínas em levedura e 623 em micélio, respectivamente. Comparadas as duas fases do fungo, 440 proteínas foram mais abundantes em levedura e 388 em micélio. Em levedura, enzimas relacionadas ao ciclo do ácido tricarboxílico e resposta ao estresse por temperatura tiveram maior abundância. Entre as proteínas que foram mais abundantes em micélio estão algumas relacionadas à via glicolítica e à fermentação alcoólica. Para identificação de potenciais alvos antigênicos na forma parasitária de H. capsulatum foram utilizados os métodos de coimunoprecipitação e posterior cromatografia líquida acoplada à espectrometria de massas para identificação dessas proteínas. Desta forma, foram identificadas três proteínas (antígeno M, catalase P e YPS-3) que reagiram apenas contra soros de pacientes com histoplasmose, sendo potenciais alvos antigênicos. Estes dados indicam a possibilidade da utilização destas proteínas em novos métodos para o diagnóstico da histoplasmose. Ainda, as análises de categoria funcional das proteínas identificadas no proteoma, forneceram uma melhor compreensão da reorganização metabólica que ocorre na transição morfológica de levedura para micélio.

Partial characterization of Plasmodium falciparum trophozoite proteome under treatment with quinine, mefloquine and the natural antiplasmodial diosgenone / Caracterización parcial del proteoma del trofozoíto de Plasmodium falciparum bajo tratamiento con quinina, mefloquina y el compuesto natural diosgenona

Introduction: Despite efforts to control malaria, around 10% of the world population is at risk of acquiring this disease. Plasmodium falciparum accounts for the majority of severe cases and deaths. Malaria control programs have failed due to the therapeutic failure of first-line antimalarials and to parasite resistance. Thus, new and better therapeutic alternatives are required. Proteomic analysis allows determination of protein expression levels under drug pressure, leading to the identification of new therapeutic drug targets and their mechanisms of action. Objective: The aim of this study was to analyze qualitatively the expression of P.falciparum trophozoite proteins (strain ITG2), after exposure to antimalarial drugs, through a proteomic approach. Materials and methods: In vitro cultured synchronized parasites were treated with quinine, mefloquine and the natural antiplasmodial diosgenone. Protein extracts were prepared and analyzed by two-dimensional electrophoresis. The differentially expressed proteins were selected and identified by MALDI-TOF mass spectrometry. Results: The following proteins were identified among those differentially expressed in the parasite in the presence of the drugs tested: enolase (PF10_0155), calcium-binding protein (PF11_0098), chaperonin (PFL0740c), the host cell invasion protein (PF10_0268) and proteins related to redox processes (MAL8P1.17). These findings are consistent with results of previous studies where the parasite was submitted to pressure with other antimalarial drugs. Conclusion: The observed changes in the P. falciparum trophozoite protein profile induced by antimalarial drugs involved proteins mainly related to the general stress response.

Introducción. A pesar de los esfuerzos para controlar la malaria, esta sigue siendo un problema de salud pública. Plasmodium falciparum es responsable de la mayoría de los casos graves y de las muertes. Los programas de control de la malaria han sido cuestionados debido al fracaso del tratamiento y a la resistencia del parásito a los antipalúdicos de primera línea, por lo que se requieren nuevas y mejores alternativas. El análisis proteómico permite identificar y determinar los niveles de expresión de las proteínas bajo la presión de los medicamentos, lo que posibilita la identificación de nuevos blancos terapéuticos y mecanismos de acción. Objetivo. Analizar cualitativamente la expresión diferencial de proteínas del citosol del trofozoíto de P. falciparum bajo tratamiento con quinina, mefloquina y el compuesto natural diosgenona mediante una aproximación proteómica. Materiales y métodos. Se trataron trofozoítos sincronizados y cultivados in vitro de P. falciparum (cepa ITG2) con quinina, mefloquina y el compuesto natural diosgenona. Los extractos proteicos se prepararon y analizaron por electroforesis bidimensional. Las proteínas con aparente expresión diferencial se seleccionaron e identificaron mediante espectrometría de masas MALDI-TOF. Resultados. Se encontraron las siguientes proteínas diferencialmente expresadas en el trofozoíto: la enolasa (PF10_0155), la proteína de unión a calcio (PF11_0098), la chaperonina (PFL0740c), la proteína de invasión a la célula del huésped (PF10_0268) y la proteína relacionada con procesos de reducción y oxidación (redox) (MAL8P1.17). Estos hallazgos son congruentes con resultados previos de estudios en los que el parásito fue presionado con otros medicamentos antipalúdicos. Conclusión. Los cambios observados en el perfil de proteínas del trofozoíto de P. falciparum tratado con antipalúdicos involucraron preferencialmente proteínas relacionadas con la respuesta al estrés general.

Estudo Descritivo Molecular de Pacientes com RASopatia

As RASopatias são um grupo de doenças cujos pacientes apresentam alterações constitucionais em genes que participam de uma mesma via de sinalização celular denominada Ras/MAPK, que desempenha um papel importante na proliferação, diferenciação, migração celular e apoptose, além de estar associada a processos carcinogênicos. Apesar dos avanços em métodos diagnósticos, cerca de 20 a 25% dos casos permanecem inconclusivos, o que impulsiona pesquisas que buscam alterações em outros níveis de regulação da via, como RNAs não codificantes e proteínas. O primeiro capítulo deste estudo, avalia um grupo de 6 pacientes diagnosticados clinicamente com RASopatia e com exomas sequenciados. Foram obtidos dados sobre mutações em seus miRNAs. O segundo capítulo relata o caso de um paciente com suspeita clínica de síndrome de Costello, mas sem mutações detectadas. Foram avaliados, in silico, dados sobre miRNAs reguladores do gene HRAS, bem como os diferentes tecidos nos quais o HRAS é expresso. Para o capítulo 3 foi realizado um estudo comparativo entre gêmeas com diagnóstico clínico de síndrome de Noonan, mas com fenótipo discordante. Foi realizado um array por RT-qPCR para diferentes RNAs reguladores e um estudo comparativo de proteoma com análise de vias biológicas, processos biológicos e genes alvo da regulação de fatores de transcrição putativos. No estudo de miRNAs foram encontradas mutações em heterozigose, que são de difícil avaliação em ensaios de expressão. No estudo de caso do paciente S4 (síndrome de Costello), não foram encontradas mutações nos miR-181d-5p, let-7a-5p, miR-143-3p, miR-181a-5p, miR-139-5p, miR-663a e let-7b-5p, descritos como reguladores do HRAS. Também não foram encontrados tecidos viáveis para coleta e análise da expressão do HRAS Na expressão de RNAs reguladores nas gêmeas (S16 e S17) foram encontrados níveis de expressão aumentados em S17 para Lnc-C21orf33-1, ERBS3/SBNO2e, miR-200be, CTBP1-AS e Lnc_DC. Na análise do proteoma, foram encontradas diferenças de expressão em vias de integrinas, proteoglicanos e trombinas, além de diferenças em processos de transdução de sinal, crescimento e manutenção celular e metabolismo. Os genes com sítio de ligação para os fatores de transcrição como RREB1, ETS1, EGR1 e TBX5 também possuíam expressão diferente entre as gêmeas. Os resultados aqui apresentados apontam novos caminhos para estudos moleculares das RASopatias que possam preencher as lacunas diagnósticas ainda pendentes.