Detecção de Variantes nos genes MSH2, MSH6, MLH1 e PMS2 utilizando Sequenciamento de Nova Geração / [Detection of Variants in the MSH2, MSH6, MLH1 and PMS2 using Nova Sequencing Generation]

RESUMO

A Síndrome de Lynch (SL) é uma herança autossômica dominante de alta penetrância, que atinge aproximadamente 3% dos pacientes com câncer colorretal. Os indivíduos acometidos apresentam mutações germinativas em um dos genes responsáveis pelo reparo de DNA por mal pareamento (Mismatch Repair- MMR) MSH2, MLH1, MSH6 ou PMS2. Por serem genes longos, a identificação de mutações nestes genes se torna demorada e com custo elevado. Desta maneira, o projeto teve como objetivo padronizar uma estratégia de identificação de variantes que permitisse reduzir os custos e tempo de rastreamento molecular dos genes MMR. Para isso, foram padronizadas 16 reações de PCRs-multiplex para os genes MSH2, MLH1 e MSH6 e 5 reações de PCRs de longo alcance para o gene PMS2. Estes produtos foram sequenciados utilizando a tecnologia de Nova Geração (NGS), através do equipamento HiSeq2500. A estratégia foi validada através do sequenciamento pelo método de Sanger dos genes de MMR em 66 pacientes, provenientes de quatro centros distintos do Brasil (INCARJ, HCPA- RS, HJUBB- PA e ACCAM- SP), e que preencheram os critérios de Bethesda para SL. As profundidades médias de cobertura obtidas para os genes MSH2, MSH6, MLH1 e PMS2 foram de 7.988, 36.313, 11.899 e 4.772 vezes, respectivamente. Foram identificadas 98 alterações em éxons e íntrons dos quatro genes, sendo que 25 eram patogênicas ou VUS (7 em MSH2, 5 em MSH6, 12 em MLH1 e 1 em PMS2) e foram encontradas em 32 pacientes. A estratégia padronizada foi eficaz na identificação de variantes dos genes MMR, permitiu reduzir em três vezes o número de reações de PCR realizadas por amostra e em 2,15 vezes o custo de rastreamento molecular para os quatro genes MMR. Dos fragmentos sequenciados, 3,1% apresentaram profundidade média de cobertura <30X e não foram eficientes na detecção de sítios variáveis nos genes MMR

ABSTRACT

Lynch Syndrome (LS) is an autosomal dominant inheritance of high penetrance that affects approximately 3% of the cases of colorectal cancer. Individuals affected with this syndrome inherit germline mutations in one of the genes responsible for the Mismatch Repair MSH2, MLH1, MSH6 or PMS2. These large numbers of genes turns mutations' identification time consuming and costly. The project aimed to establish a molecular screening method in order to optimize the cost-effectiveness for screening these genes. We performed 16 Multiplex PCRs for MSH2, MSH6 and MLH1 genes and 5 Long-Range PCRs for PMS2 gene, coupled with Next Generation Sequencing (NGS) technologies. Our strategy was validated by the screening of sixty-six patients who filled Bethesda criteria for LS from different hospitals of Brazil (INCA-RJ, HCPA-RS, HJUBB-PA and ACCAM-SP). The depth of coverage for MSH2, MSH6, MLH1 and PMS2 genes was 7.988, 36.313, 11.899 and 4.772 times, respectively. Ninety-eight alterations were found in exons and introns regions for the four MMR genes. From this, 25 were pathogenic or VUS found in 32 patients (7 in MSH2, 5 in MSH6, 12 in MLH1 e 1 in PMS2). The strategy was efficient to identify genetic changes at the MMR genes, since allowed to reduce to 3 times the number of PCR reactions performed per patient and to reduce in 2,15 times the costs to molecular screening of the four MMR genes. Approximately 3% of the amplicons sequenced had a depth of coverage <30X and were not efficient in variation detection at MMR genes