Desenvolvimento e avalia��o comparativa de metodologias baseadas na PCR para o diagn�stico molecular e identifica��o espec�fica de agentes etiol�gicos da leishmaniose tegumentar que circulam em �reas end�micas brasileiras / Development and benchmarking of methodologies based on PCR for molecular diagnosis and identification of specific etiologic agents of cutaneous leishmaniasis circulating in Brazilian endemic areas

RESUMO

A leishmaniose � um complexo de doen�as caracterizada n�o s� pelo consider�vel pleomorfismo cl�nico, mas tamb�m pela varia��o epidemiol�gica, devido � not�vel diversidade de esp�cies de Leishmania e de vetores envolvidos no ciclo de transmiss�o e, quando aplic�vel, os seus grupos de reservat�rios. O diagn�stico da infec��o por Leishmania associado � identifica��o da esp�cie causal � importante para o progn�stico, defini��o de esquemas terap�uticos adequados e para vigil�ncia epidemiol�gica da doen�a. Neste contexto, os m�todos baseados na PCR tem sido os mais investigados e por isso muitos m�todos tem sido descritos. O principal objetivo deste estudo foi estabelecer uma metodologia que apresentasse uma boa sensibilidade para ser utilizada no diagn�stico da leishmaniose cut�nea e que fosse capaz de identificar o agente etiol�gico causal da infec��o ao n�vel espec�fico. Para isto, neste trabalho utilizamos diferentes metodologias baseadas na PCR que j� foram empregadas em v�rios estudos enfocando o dian�stico molecular das leishmanioses PCR kDNA, PCR ITS1 e PCR g6p. O limite de detec��o, sensibilidade frente a amostras cl�nicas obtidas de pacientes com LC e a capacidade destas metodologias em discriminar entre as esp�cies relacionadas com a LC humana no Brasil foram avaliados. Al�m disso, considerando resultados anteriores do nosso grupo que indicaram que regi�es do gene hsp70 poderiam ser utilizadas para o alcance deste objetivo, desenvolvemos metodologias de PCR direcionadas para a amplifica��o de fragmentos que correspondiam a distintas regi�es do gene hsp70, com tamanho variando entre 230pb a 390pb. Considerando as quatro regi�es que foram analisadas, escolhemos uma (aqui denominada de PCR hsp70C) por ter apresentado o melhor limite de detec��o de DNA de Leishmania e que, atrav�s da PCR RFLP hsp70C, foi capaz de discriminar todas as esp�cies de Leishmania, pat�genos humanos, que circulam no Brasil, quanco cepas de refer�ncia foram analisadas.