Leishmania vaccine development: A comprehensive review.

Infectious diseases like leishmaniasis, malaria, HIV, tuberculosis, leprosy and filariasis are responsible for an immense burden on public health systems. Among these, leishmaniasis is under the category I diseases as it is selected by WHO (World Health Organization) on the ground of diversity and complexity. High cost, resistance and toxic effects of Leishmania traditional drugs entail identification and development of therapeutic alternative. Since the natural infection elicits robust immunity, consistence efforts are going on to develop a successful vaccine. Clinical trials have been conducted on vaccines like Leish-F1, F2, and F3 formulated using specific Leishmania antigen epitopes. Current strategies utilize individual or combined antigens from the parasite or its insect vector's salivary gland extract, with or without adjuvant formulation for enhanced efficacy. Promising animal data supports multiple vaccine candidates (Lmcen-/-, LmexCen-/-), with some already in or heading for clinical trials. The crucial challenge in Leishmania vaccine development is to translate the research knowledge into affordable and accessible control tools that refines the outcome for those who are susceptible to infection. This review focuses on recent findings in Leishmania vaccines and highlights difficulties facing vaccine development and implementation.

Interleukin-7 potentiates MAPK10-elicited host-protective vaccine against Leishmania donovani.

Leishmania donovani causes the potentially fatal disease visceral leishmaniasis for which neither a vaccine nor an adjuvant for human use exists. Although interleukin-7 (IL-7) is implicated in CD4+ T-cell response stabilization, its anti-leishmanial function is uncertain. Therefore, we examined whether IL-7 would potentiate the efficacy of Leishmania major-expressed MAPK10 (LmjMAPK10; M10)-elicited anti-leishmanial host-protective response. We observed that aligning with IL-7R expression, IL-7 increased IFN-γ-secreting TH1 cell but reduced IL-4-producing TH2 cells and production of IL-10 and TGF-ß effectuating anti-leishmanial functions in susceptible BALB/c mouse-derived macrophages. Co-culturing IL-7-pre-treated L. donovani-infected macrophages with L. donovani-infected BALB/c-derived T cells induced IFN-γ-dominated TH1 type anti-leishmanial function. IL-7 treatment of L. donovani-infected BALB/c mice significantly reduced splenic and hepatic parasite loads. Co-culturing CD4+ T cells from IL to 7-treated mice with L. donovani-infected macrophages reduced amastigote numbers suggesting IL-7-elicited host-protective effector T cells. Priming BALB/c with M10 + IL-7 reduced the splenic parasite burden more effectively than that was observed in M10-primed mice. An enhanced protection against L. donovani infection was accompanied by enhanced IL-12 and IFN-γ, but suppressed IL-10 and IL-4, response and host-protective TH1 and memory T cells. These results indicate IL-7-induced leishmanial antigen-specific memory T cell response that protects a susceptible host against L. donovani infection.

Manufacturing and preclinical toxicity of GLP grade gene deleted attenuated Leishmania donovani parasite vaccine.

Centrin1 gene deleted Leishmania donovani parasite (LdCen1-/-) was developed and extensively tested experimentally as an intracellular stage-specific attenuated and immunoprotective live parasite vaccine candidate ex vivo using human PBMCs and in vivo in animals. Here we report manufacturing and pre-clinical evaluation of current Good-Laboratory Practice (cGLP) grade LdCen1-/- parasites, as a prerequisite before proceeding with clinical trials. We screened three batches of LdCen1-/- parasites manufactured in bioreactors under cGLP conditions, for their consistency in genetic stability, attenuation, and safety. One such batch was preclinically tested using human PBMCs and animals (hamsters and dogs) for its safety and protective immunogenicity. The immunogenicity of the CGLP grade LdCen1-/- parasites was similar to one grown under laboratory conditions. The cGLP grade LdCen1-/- parasites were found to be safe and non-toxic in hamsters and dogs even at 3 times the anticipated vaccine dose. When PBMCs from healed visceral leishmaniasis (VL) cases were infected with cGLP LdCen1-/-, there was a significant increase in the stimulation of cytokines that contribute to protective responses against VL. This effect, measured by multiplex ELISA, was greater than that observed in PBMCs from healthy individuals. These results suggest that cGLP grade LdCen1-/- manufactured under cGMP complaint conditions can be suitable for future clinical trials.

From classical approaches to new developments in genetic engineering of live attenuated vaccine against cutaneous leishmaniasis: potential and immunization.

Despite the development of a vaccine against cutaneous leishmaniasis in preclinical and clinical studies, we still do not have a safe and effective vaccine for human use. Given this situation, the search for a new prophylactic alternative to control leishmaniasis should be a global priority. A first-generation vaccine strategy-leishmanization, in which live Leishmania major parasites are inoculated into the skin to protect against reinfection, is taking advantage of this situation. Live attenuated Leishmania vaccine candidates are promising alternatives due to their robust protective immune responses. Importantly, they do not cause disease and could provide long-term protection following challenges with a virulent strain. In addition to physical and chemical methods, genetic tools, including the Cre-loxP system, have enabled the selection of safer null mutant live attenuated Leishmania parasites obtained by gene disruption. This was followed by the discovery and introduction of CRISPR/Cas-based gene editing tools, which can be easily and precisely used to modify genes. Here, we briefly review the immunopathology of L. major parasites and then present the classical methods and their limitations for the production of live attenuated vaccines. We then discuss the potential of current genetic engineering tools to generate live attenuated vaccine strains by targeting key genes involved in L. major pathogenesis and then discuss their discovery and implications for immune responses to control leishmaniasis.

Vaccine efficacy induced by virus-like particles containing Leishmania donovani surface glycoprotein GP63.

Leishmania donovani surface glycoprotein 63 (GP63) is a major virulence factor involved in parasite escape and immune evasion. In this study, we generated virus-like particles (VLPs) expressing L. donovani GP63 using the baculovirus expression system. Mice were intramuscularly immunized with GP63-VLPs and challenged with L. donovani promastigotes. GP63-VLP immunization elicited higher levels of L. donovani antigen-specific serum antibodies and enhanced splenic B cell, germinal center B cell, CD4+, and CD8+ T cell responses compared to unimmunized controls. GP63-VLPs inhibited the influx of pro-inflammatory cytokines IFN-γ and IL-6 in the livers, as well as thwarting the development of splenomegaly in immunized mice. Upon L. donovani challenge infection, a drastic reduction in splenic parasite burden was observed in VLP-immunized mice. These results indicate that GP63-VLPs immunization conferred protection against L. donovani challenge infection by inducing humoral and cellular immunity in mice.

PLGA nanoparticle-delivered Leishmania antigen and TLR agonists as a therapeutic vaccine against cutaneous leishmaniasis in BALB/c mice.

Leishmaniasis, caused by Leishmania (L.) species, remains a neglected infection. Therapeutic vaccination presents a promising strategy for its treatment. In this study, we aimed to develop a therapeutic vaccine candidate using Leishmaniaantigens (SLA) and Toll-like receptor (TLR) 7/8 agonist (R848) encapsulated into the poly (lactic-co-glycolic acid) (PLGA) nanoparticles (NPs). Moreover, TLR1/2 agonist (Pam3CSK4) was loaded onto the NPs. The therapeutic effects of these NPs were evaluated in L. major-infected BALB/c mice. Footpad swelling, parasite load, cellular and humoral immune responses, and nitric oxide (NO) production were analyzed. The results demonstrated that the PLGA NPs (SLA-R848-Pam3CSK4) therapeutic vaccine effectively stimulated Th1 cell responses, induced humoral responses, promoted NO production, and restricted parasite burden and lesion size.Our findings suggest that vaccination with SLA combined with TLR1/2 and TLR7/8 agonists in PLGA NPs as a therapeutic vaccine confers strong protection againstL. majorinfection. These results represent a novel particulate therapeutic vaccine against Old World cutaneous leishmaniasis.

Therapy with radio-attenuated vaccine in experimental murine visceral leishmaniasis showed enhanced T cell and inducible nitric oxide synthase levels, suppressed tumor growth factor-beta production with higher expression of some signaling molecules

Background: Visceral leishmaniasis (VL) or Kala-Azar (KA) is one of the most deadly forms of disease among all neglected tropical diseases. There are no satisfactory drugs or vaccine candidates available for this dreaded disease. Our previous studies showed promising therapeutic and prophylactic efficacy of the live, radio-attenuated parasites through intramuscular (I.M.) and intraperitoneal (I.P.) route in BALB/c mice model. Methods: The T-cell proliferation level, the mRNA expression level of inducible nitric oxide synthase (iNOS) and tumor growth factor-beta (TGF-β) genes and finally the phosphorylation levels of phosphoinositide dependent kinase 1 (PDK1), phosphoinositide 3 kinase (PI3K) and p38 mitogen activated protein kinase (p38MAPK) molecules were checked in BALB/c mice model immunized with radio-attenuated Leishmania donovani parasites through I.M. route. Results: Higher T-cell proliferation, increased iNOS level, and suppressed TGF-β level were found in treated infected animal groups (100 and 150 Gy) in relation to untreated infected animals. Likewise, phosphorylation levels of PDK1, PI3K and p38MAPK of these two groups were increased when compared to untreated infected controls. Conclusion: The clearance of the parasites from treated infected groups of animals may be mediated by the restoration of T-cell due to therapy with radio-attenuated L. donovani parasites. The killing of parasites was mediated by increase in nitric oxide release through PDK1, PI3K and p38MAPK signaling pathways. A lower TGF-β expression has augmented the restored Th1 ambience in the 100 and 150 Gy treated animal groups proving further the efficacy of the candidate vaccine. .

Experimental models in vaccine research: malaria and leishmaniasis

Animal models have a long history of being useful tools, not only to test and select vaccines, but also to help understand the elaborate details of the immune response that follows infection. Different models have been extensively used to investigate putative immunological correlates of protection against parasitic diseases that are important to reach a successful vaccine. The greatest challenge has been the improvement and adaptation of these models to reflect the reality of human disease and the screening of vaccine candidates capable of overcoming the challenge of natural transmission. This review will discuss the advantages and challenges of using experimental animal models for vaccine development and how the knowledge achieved can be extrapolated to human disease by looking into two important parasitic diseases: malaria and leishmaniasis.

Transmission blocking vaccines to control insect-borne diseases: a review

Insect-borne diseases are responsible for severe mortality and morbidity worldwide. As control of insect vector populations relies primarily on the use of insecticides, the emergence of insecticide resistance as well to unintended consequences of insecticide use pose significant challenges to their continued application. Novel approaches to reduce pathogen transmission by disease vectors are been attempted, including transmission-blocking vaccines (TBVs) thought to be a feasible strategy to reduce pathogen burden in endemic areas. TBVs aim at preventing the transmission of pathogens from infected to uninfected vertebrate host by targeting molecule(s) expressed on the surface of pathogens during their developmental phase within the insect vector or by targeting molecules expressed by the vectors. For pathogen-based molecules, the majority of the TBV candidates selected as well as most of the data available regarding the effectiveness of this approach come from studies using malaria parasites. However, TBV candidates also have been identified from midgut tissues of mosquitoes and sand flies. In spite of the successes achieved in the potential application of TBVs against insect-borne diseases, many significant barriers remain. In this review, many of the TBV strategies against insect-borne pathogens and their respective ramification with regards to the immune response of the vertebrate host are discussed.

Antigenic extracts of Leishmania braziliensis and Leishmania amazonensis associated with saponin partially protects BALB/c mice against Leishmania chagasi infection by suppressing IL-10 and IL-4 production

This study evaluated two vaccine candidates for their effectiveness in protecting BALB/c mice against Leishmania chagasiinfection. These immunogenic preparations were composed of Leishmania amazonensisor Leishmania braziliensisantigenic extracts in association with saponin adjuvant. Mice were given three subcutaneous doses of one of these vaccine candidates weekly for three weeks and four weeks later challenged with promastigotes of L. chagasiby intravenous injection. We observed that both vaccine candidates induced a significant reduction in the parasite load of the liver, while the L. amazonensisantigenic extract also stimulated a reduction in spleen parasite load. This protection was associated with a suppression of both interleukin (IL)-10 and IL-4 cytokines by spleen cells in response to L. chagasiantigen. No change was detected in the production of IFN-γ. Our data show that these immunogenic preparations reduce the type 2 immune response leading to the control of parasite replication.

Subcutaneous immunization against Leishmania major - infection in mice: efficacy of formalin-killed promastigotes combined with adjuvants / Imunização subcutânea na infecção do camundongo pela Leishmania major: eficácia dos promastigotos mortos pela formalina combinada com adjuvantes

Formalin-killed promastigotes (FKP) of Leishmania major, in combination with Montanide ISA 720 (MISA), BCG or alum were used in vaccination of an inbred murine model against cutaneous leishmaniasis (CL). Significant and specific increases in anti-FKP IgG responses were detected for both alum-FKP and BCG-FKP compared to MISA-FKP (p < 0.001). Significant increases in splenic lymphocyte recall proliferation was obtained in the MISA-FKP vaccinated mice compared to alum-FKP or BCG-FKP vaccinated groups (p < 0.01). The highest interferon-ã responses were observed in the BCG-FKP group followed by the MISA-FKP while the alum-FKP gave the least responses. Significantly reduced lesion sizes were obtained in the MISA-FKP group compared to the BCG/alum adjuvants-FKP vaccinated groups. Although the BCG-FKP group showed the highest IFN-ã responses, it failed to control cutaneous lesions. Significant reductions in parasite numbers were observed in the MISA-FKP and BCG-FKP vaccinated groups (p < 0.001). There was a good correlation between parasite burden and IFN-ã level indicating IFN-ã response as a sensitive parameter of the immune status. In conclusion, MISA-FKP is the most efficacious vaccine formulation against murine cutaneous leishmaniasis.

Promastigotos mortos pela formalina (FKP) de Leishmania major combinados com Montanide ISA 720 (MISA), BCG ou alumen foram usados na vacinação de modelo murino cutâneo de leishmaniose (CL). Aumento significante e específico de resposta IgG anti FKP foram detectados tanto no FKP com alumen como naquele com BCG comparados ao MISA-FKP (p < 0,001). Aumento significante da proliferação esplênica de linfócitos de memória foi obtida nos camundongos vacinados com MISA-FKP quando comparados aos grupos vacinados com alumen-FKP ou BCG-FKP (p < 0,01). As maiores respostas por interferon-gama foram observadas no grupo BCG-FKP seguido pelo MISA-FKP enquanto que o alumen-FKP deu a menor resposta. No grupo MISA-FKP foram obtidas reduções significantes do tamanho das lesões quando comparado aos grupos vacinados com BCG/adjuvante de alumen-FKP. Embora o grupo BCG-FKP tenha mostrado a maior resposta por interferon-gama, não houve controle das lesões cutâneas. Redução significante no número de parasitas foi observada tanto no grupo vacinado com MISA-FKP como no BCG-FKP (p < 0,001). Houve boa correlação entre a carga parasitária e o nível de interferon-gama indicando que a resposta do interferon-gama é parâmetro sensível do estado imunológico. Em conclusão, MISA-FKP é a forma mais eficaz de vacina contra a leishmaniose cutânea murina.

Comparative evaluation of phenol and thimerosal as preservatives for a candidate vaccine against American cutaneous leishmaniasis

For decades thimerosal has been used as a preservative in the candidate vaccine for cutaneous leishmaniasis, which was developed by Mayrink et al. The use of thimerosal in humans has been banned due to its mercury content. This study addresses the standardization of phenol as a new candidate vaccine preservative. We have found that the proteolytic activity was abolished when the test was conducted using the candidate vaccine added to merthiolate (MtVac) as well as to phenol (PhVac). The Montenegro's skin test conversion rates induced by MtVac and by PhVac was 68.06 percent and 85.9 percent, respectively, and these values were statistically significant (p < 0.05). The proliferative response of peripheral mononuclear blood cells shows that the stimulation index of mice immunized with both candidate vaccines was higher than the one in control animals (p < 0.05). The ability of the candidate vaccines to induce protection in C57BL/10 mice against a challenge with infective Leishmania amazonensis promastigotes was tested and the mice immunized with PhVac developed smaller lesions than the mice immunized with MtVac. Electrophoresis of phenol-preserved antigen revealed a number of proteins, which were better preserved in PhVac. These results do in fact encourage the use of phenol for preserving the immunogenic and biochemical properties of the candidate vaccine for cutaneous leishmaniasis.

The utility of rhesus monkey (Macaca mulatta) and other non-human primate models for preclinical testing of Leishmania candidate vaccines

Leishmaniasis causes significant morbidity and mortality, constituting an important global health problem for which there are few effective drugs. Given the urgent need to identify a safe and effective Leishmania vaccine to help prevent the two million new cases of human leishmaniasis worldwide each year, all reasonable efforts to achieve this goal should be made. This includes the use of animal models that are as close to leishmanial infection in humans as is practical and feasible. Old world monkey species (macaques, baboons, mandrills etc.) have the closest evolutionary relatedness to humans among the approachable animal models. The Asian rhesus macaques (Macaca mulatta) are quite susceptible to leishmanial infection, develop a human-like disease, exhibit antibodies to Leishmania and parasite-specific T-cell mediated immune responses both in vivo and in vitro, and can be protected effectively by vaccination. Results from macaque vaccine studies could also prove useful in guiding the design of human vaccine trials. This review summarizes our current knowledge on this topic and proposes potential approaches that may result in the more effective use of the macaque model to maximize its potential to help the development of an effective vaccine for human leishmaniasis.

Imunização de camundongos com fragmentos recombinantes de cinesina de Leishmania chagasi e/ou plasmídeos codificando Il-12 e IL-2 murinas / Immunization of mice with recombinant fragments of Leishmania chagasi kinesin and/or plasmids encoding IL-12 and IL-2 murine

Leishmaniose visceral zoonótica (LV) é uma doença que afeta homens e cães e é causada por protozoários das espécies Leishmania infantum e Leishmania chagasi. O cão doméstico é o principal reservatório do agente causal. Uma vacina efetiva contra a LV canina poderá contribuir para o controle da infecção e/ou doença humana e canina. A resposta imune protetora contra a LV canina é do tipo celular (Th1). Em nosso laboratório, dentre um grupo de cinco antígenos ecombinantes selecionados de uma biblioteca de cDNA de L. chagasi, usando-se uma mistura de soro de cães naturalmente infectados e que exibiam resposta imune humoral e celular específica, um fragmento da extremidade carboxila de uma cinesina com cauda de 6 histidinas (rLci2B-NH6), para permitir a purificação, foi escolhido para a avaliação do seu potencial como candidato a componente de uma vacina contra LV canina. No presente trabalho foi avaliada a imunização de camundongos BALB/c com rLci2BNH6/ saponina em associação com os plasmídeos pcDNA3.1-scmu-IL-12 e/ou pcDNA3.1-mu-IL-2. Os animais imunizados com rLci2B-NH6/saponina em associação com a IL-12 e/ou IL-2 produziram anticorpos IgG, IgG2a e IgG1 específicos. Esplenócitos desses animais exibiram proliferação, mas não produziram IFN-γ ou IL-5 após estimulação in vitro com rLci2B-NH6. Esses resultados sugerem que a adição de pcDNA3.1-mu-IL-2 no protocolo de imunização não é capaz de promover uma resposta imune predominantemente Th1. Também foi avaliada a imunização de camundongos com proteína recombinante quimérica (rLci2-NTCT-NH6) formada pelos domínios não repetitivos presentes nas extremidades amina e carboxila codificadas pelo gene da cinesina. Camundongos BALB/c imunizados com rLci2- NT-CT-NH6 ou uma proteína recombinante químerica controle, contendo 5 domínios repetitivos presentes em rLci2B-NH6 entre os domínios não repetitivos de rLci2-NT-CTNH6, apresentaram produção de IgG, IgG2a e IgG1. Esplenócitos desses animais exibiram proliferação, mas não produziram IFN-γ e apenas esplenócitos dos camundongos imunizados com rLci2-NT-5R-CT-NH6 sintetizaram IL-5, após estimulação in vitro com as respectivas proteínas. Contudo, durante a purificação de rLci2-NT-CT-NH6 e rLci2-NT-5R-CT-NH6 ocorreu intensa proteólise que pode ter resultado na destruição de epítopos capazes de induzir resposta Th1. Previamente, em nosso laboratório, foi observada a morte de alguns camundongos injetados com 100 μg saponina/dose, por isso, doses menores de saponina (50 ou 25 μg) foram avaliadas como adjuvante na indução de resposta imune a rLci2B-NH6. Os resultados da mensuração dos anticorpos foram semelhantes nos três grupos. Curiosamente, somente esplenócitos do grupo injetado com 25 μg/dose exibiram proliferação específica. O grupo injetado com 100 μg/dose produziu IFN-γ e IL-5 e o grupo injetado com 50 μg/dose sintetizou IFN-γ, mas não produziu IL-5, após estimulação in vitro com rLci2B-NH6.

Papel da saliva do Lutzomyia intermedia na infecção por Leismania braziliensis: desenvolvimento de vacinas para Leishmaniose Tegumentar / Role of saliva of Lutzomyia intermedia infection Leismania braziliensis: development of vaccines for leishmaniasis

Papel da saliva do Lutzomyia intermedia na infecção por Leishmania braziliensis: desenvolvimento de vacinas para Leishmaniose Tegumentar. A saliva de flebotomíneos tem uma série de componentes farmacológicos e imunomoduladores, e a imunidade à saliva protege contra a infecção por Leishmania. Neste trabalho, se estudou a resposta immune contra a saliva de Lutzomyia intermedia, o principal vetor da Leishmania braziliensis no Brasil, e os efeitos da pré-exposição à saliva na infecção por L. braziliensis. Foi avaliada a resposta imune a distintas proteínas da saliva de L. intermedia, as quais produziram desfechos contrastantes na infecção por L. braziliensis. Camundongos BALB/c imunizados com o sonicado de glândula salivar (SGS) de L. intermedia desenvolveram anticorpos IgG 1 contra saliva e uma resposta celular com a produção das citocinas IFN-y e IL-4. O infiltrado inflamatório nos animais imunizados com SGS foi composto por muitas células polimofonucleares e poucas mononucleares. Camundongos desafiados com L. braziliensis, na presença da saliva, não foram protegidos contra a infecção apesar de desenvolverem uma lesão mais tardia. O sítio de inoculação e o linfonodo regional apresentaram uma contínua replicação parasitária e uma baixa razão de IFN-y por IL-4, indicando que a pré-exposição a saliva de L. intermedia modula a resposta imune. Além do mais, numa área endêmica para leishmaniose cutânea, pacientes com lesões cutânea ativa apresentaram uma elevada resposta humoral contra a saliva quando comparados aos indivíduos com teste de pele positivo para leishmaniose. A imunização com plasmídeos que codificam distintas proteínas salivares de L. intermedia modulou a infecção por L. braziliensis. Camundongos BALB/c imunizados com LliSP0l e LiSP05 tiveram uma proteção parcial contra a infecção enquanto a imunização com LliSP07 exacerbou a infecção, sugerindo que a imunização com essas distintas moléculas altera o curso da imunidade à Leishmania. Esses resultados sugerem que a pré-exposição a saliva de flebotomíneos possui um importante papel no desfecho da leishmaniose cutânea, em ambos camundongos. Esses resultados enfatizam possíveis obstáculos no desenvolvimento de vacinas baseadas na saliva de L. intermedia e a necessidade de identificar e selecionar candidatos individuais ao invés da saliva total, a qual pode favorecer uma resposta não protetora.

Avaliação da imunogenicidade de dois novos imunobiológicos candidatos a vacina contra Leishmaniose visceral canina

Considerando a importância de estratégias imunoprofiláticas para o controle da leishmaniose visceral, a inexistência de drogas capazes de curar cães infectados e o aumento de casos de resistência aos antimoniais pentavalentes, o presente trabalho buscou avaliar a imunogenicidade de dois novos imunobiológicos candidatos a vacina contra leishmaniose visceral canina (LVC). Observa-se uma lacuna em estudos que buscam avaliar a imunogenicidade pós-vacinal de imunobiológicos anti-LVC. Assim, o. presente estudo propôs uma análise detalhada da imunogenicidade considerando diversos biomarcadores da resposta imune celular e humoral após as três doses das diferentes estratégias vacinais. Trinta e cinco cães sem raça definida foram subdivididos em sete grupos experimentais, entre os quais: (i) grupo controle C (n = 10) que recebeu 1 mL de salina estéril a 0,9%; (ii) grupo LB (n = 5) que recebeu 600 μg de proteína de Leishmania braziliensis em 1 mL de salina estéril a 0,9%; (iii) grupo Sap (n = 5) que recebeu 1 mg de saponina em 1 mL de salina estéril a 0,9%; (iv) grupo LBSap (n = 5)que recebeu 600 μg de proteína de L. braziliensis associado a 1 mg de saponina em 1 mL de salina estéril a 0,9%; (v) grupo Sal (n = 5) que recebeu extrato de glândula salivar de Lutzomyia longipalpis (SGE) equivalente ao conteúdo de 5 ácinos da glândula salivar em 1 mL de salina estéril a 0,9%; (vi) grupo LBSal (n = 5) que recebeu 600 μg de promastigotas de L. braziliensis associado ao SGE em 1 mL de salina estéril a 0,9%; (vii) grupo LBSapSal (n = 5) que recebeu 600 μg de promastigotas de L. braziliensis associado a 1 mg de saponina e ao SGE em 1 mL de salina estéril a 0,9%.. Cada animal recebeu três aplicações subcutâneas no flanco esquerdo em intervalos de quatro semanas.

Os resultados indicam que a saponina quando presente (Sap, LBSap, LBSapSal) induziu em alguns cães a formação de edema ou de pequeno nódulo local, sem apresentar lesões ulceradas ou outras alterações adversas. A avaliação da inocuidade e toxicidade das diferentes vacinas não revelou contra-indicações para utilização. A avaliação da resposta humoral revelou que os grupos LBSap e LBSapSal apresentaram aumento dos níveis de IgG total, IgG1 e IgG2 anti-Leishmania, sugerindo um perfil de resposta imune misto Th1/Th2. De forma semelhante, no grupo LBSapSal foi observado aumento dos níveis de IgG total, IgG1 e IgG2 anti-SGE, que tem sido previamente relacionado ao estabelecimento de uma resposta imune protetora anti-Leishmania. Além disto, experimentos utilizando Western blot para avaliar a reatividade de anticorpos caninos anti-proteínas do SGE evidenciaram o predomínio de proteínas com peso molecular de 35, 45 e 75 KDa, particularmente no grupo LBSapSal, sendo. relacionado a um padrão de resistência contra infecção por Leishmania. A avaliação da resposta celular contou com o estudo imunofenotípico de células mononucleares do sangue periférico (PBMC) e revelou aumento do número de linfócitos B CD21+,. linfócitos T CD5+ e das subpopulações T (CD4+ e T CD8+), indicando o estabelecimento de imunidade protetora contra infecção por Leishmania como previamente relatado na LVC. Além disto, foi observada pela análise in vitro redução do índice de proliferação utilizando VSA (vaccine soluble antigen) ou SLcA (soluble. Leishmania chagasi antigen) nos grupos LB e Sal, enquanto os grupos LBSap e LBSapSal apresentaram aumento da atividade linfoproliferativa na presença de ambos os estímulos. De forma interessante, foi demonstrado no grupo Sal correlação negativa. entre a atividade linfoproliferativa e linfócitos T CD4+ ou monócitos CD14+.

Estes resultados permitem especular que a imunização realizada no grupo Sal poderia inibir a atividade de monócitos CD14+ em ativar linfócitos T CD4+ e assim reduzir a atividade linfoproliferativa. Por outro lado, PBMC cultivados in vitro com SLcA do grupo LBSap e com VSA ou SLcA no grupo LBSapSal apresentaram aumento da atividade linfoproliferativa acompanhada pela indução de linfócitos T CD8+ antígeno-específicos.. Estes resultados sustentam a hipótese de que a vacinação com LBSap e LBSapSal estimularia o desenvolvimento de mecanismos imunoprotetores relacionados ao controle do parasitismo por Leishmania considerando a indução de linfócitos T CD8+. antígeno-específicos para proteínas relacionadas ao agente etiológico da LVC. A avaliação de potenciais células apresentadoras de antígenos (APC) revelou aumento do número de monócitos CD14+ circulantes nos grupos LBSap e LBSapSal. Além disto,altas contagens de APC foram associadas ao aumento da expressão de linfócitos MHC-I no grupo LBSap e de linfócitos CD80 e MHC-I no grupo LBSapSal, sugerindo que esta associação poderia representar a interação entre as respostas imunes inata e adaptativa, refletindo no aumento do perfil de ativação durante as imunizações. Os resultados obtidos pelas análises dos níveis de óxido nítrico (NO) pela avaliação dos níveis de nitrito no sobrenadante de cultura estimuladas com SLcA no grupo LBSap e no soro do grupo LBSapSal confirmam a hipótese de que estas vacinas induzem um perfil associado a resistência contra a infecção por Leishmania. Os resultados obtidos neste trabalho indicam que o potencial imunoprotetor induzido pelas vacinas LBSap e LBSapSal são compatíveis com o controle do agente etiológico da LVC

Aspectos clínico-epidemiológicos e imunológicos da leishmaniose tegumentar / Clinical and epidemiological features of cutaneous leishmaniasis and immunological

A leishmaniose tegumentar americana (LTA) continua sendo um problema de Saúde Publica no mundo. No Brasil, no período de 1985 a 2001, a leishmaniose tegumentar americana (LTA) vem apresentando coeficientes de detecção que oscilam entre 10,45 a 21,23 por 100.000 habitantes. Em 1993, um surto de LTA foi detectado no povoado rural de Canoa, município de Santo Amaro, Bahia. Um estudo observacional prospectivo foi delineado, com objetivo de determinar as taxas de freqüência e caracterizar c1inicamente a doença. Foram acompanhados 555 indivíduos, registrando-se 29 casas de LTA. A prevalência de LTA na população avaliada no período de estudo foi de 5,2 por cento (29/555). A espécie de leishmania envolvida na área foi caracterizada como Leishmania braziliensis, sendo o flebotomíneo a Lutzomya intermedia. Foram detectados cães e eqüídeos infectados por leishmania. Esses dados foram publicados no trabalho1. No segundo trabalho os aspectos clínico-epidemiológicos e imunológicos dos 104 indivíduos documentados como portadores de infecção subclínica foram comparados com os 29 indivíduos que desenvolveram leishmaniose cutânea (LC). A infecção subclínica foi definida como indivíduo sadio, durante os 4 anos de acompanhamento clínico, sem lesão ativa cutâneo ou mucosa, sem cicatriz sugestiva de doença passada e que apresentaram o teste de hipersensibilidade tardia positivo. O grupo de indivíduos com doença clinicamente evidente (n=29) era mais jovem (19,4 ± 12,8 anos), apresentava reação cutânea com enduração significativamente maior (17,6±1,4 mm) assim como maior propor<;ao de sorologia positiva (16/29; 55,2 por cento) ao ser comparado (p<0,05) ao grupo de infecção subclínica (n=104; DTH: 9,4±4,5 mm; sorologia positiva: 48/104;46,2 por cento). Dosagem de IFN-y, TNF-a, e IL-5 foram avaliados em sobrenadantes de células mononucleares do sangue periférico (PBMC) através da técnica de ELISA em vinte pacientes com LC e em vinte indivíduos com a forma subclínica. Os resultados mostraram que 0 nível de IFN-y [353 ± 594 pg/ml (0-2,075)] e de TNF-a, [19 ± 144 (0-364) pg/ml] eram mais baixos nos casas de leishmaniose subclínica, quando comparados aos dos indivíduos com LC [1,546 ± 1,100 pg/ml (0¬3,321) e 258 ± 253 pg/ml (0-904) respectivamente]. A media do nível de IL- 5 nos indivíduos com infeCl;ao subclínica (105 ± 160 pg/ml; 0-679) foi Iigeiramente maior (p>0,05) que o observado nos casos de LC (26 ± 41 pg/ml; 0-85). Os dados sugerem que os indivíduos que não desenvolvem a doença talvez tenham a habilidade de modular melhor a resposta imune, prevenindo-os contra o danG tecidual e desenvolvimento de lesão cutânea. No terceiro trabalho foram estudados os dados da resposta imune de 56 militares voluntários e sadios à vacinação com antígeno de leishmania (Leishvacin®) com uma ou duas doses. A reação de Montenegro não foi utilizada para seleção para evitar possível sensibilização. Esse estudo...