RESUMO
In the current study, we evaluated the mechanism of action of miltefosine, which is the first effective and safe oral treatment for visceral leishmaniasis, in Leishmania amazonensis promastigotes. Miltefosine induced a process of programmed cell death, which was determined by the externalization of phosphatidylserine, the incorporation of propidium iodide, cell-cycle arrest at the sub-G0/G1 phase and DNA fragmentation into oligonucleosome-sized fragments. Despite the intrinsic variation that is detected in Leishmania spp, our results indicate that miltefosine causes apoptosis-like death in L. amazonensis promastigote cells using a similar process that is observed in Leishmania donovani.
Assuntos
Antiprotozoários/farmacologia , Apoptose/genética , Fragmentação do DNA/efeitos dos fármacos , DNA de Protozoário/efeitos dos fármacos , Leishmania mexicana/efeitos dos fármacos , Fosforilcolina/análogos & derivados , DNA de Protozoário/genética , Citometria de Fluxo , Fosforilcolina/farmacologiaRESUMO
As peptidases do Trypanosoma cruzi, agente etiológico da doença de Chagas, são importantes fatores de virulência e alvo para quimioterapia. As aspártico peptidases ainda não foram caracterizadas neste parasito, porém, inibidores de aspártico peptidase do vírus da imunodeficiência humana (IPs-HIV) tem ação tripanocida. O objetivo desse trabalho é caracterizar as aspártico peptidases em T. cruzi. Através de análises in silico, identificamos que dos três genes anotados como aspártico peptidases, dois genes, Presenilina símile (PS) e Peptidase Peptideo Sinal símile (PPs símile), compartilham o mesmo domínio proteico, o domínio PSN (Presenilin/Signalpeptideo peptidase familly). A presenilina símile de T. cruzi possui nove domínios transmembranas e uma ampla dobra entre os domínios seis e sete, que resulta em uma espaçosa região hidrofóbica, o que indica que a presenilina símile de T. cruzi possui uma estrutura secundária altamente similar e indispensável para origem de uma presenilina ativa. A PPs símile de T. cruzi possui uma sequência de múltiplas passagens pela membrana, e revela uma grande semelhança com as presenilinas, incluindo a conservação do seu domínio. O gene anotado como DNA damage inducible Ddi 1 (Ddi 1 símile) possui o domínio retroviral peptidase (RVP), característico dessa família de peptidases. A Ddi 1 símile de T. cruzi possui o domínio UBL (ubiquitina símile)
A modelagem molecular do domínio (RVP) da proteína Ddi 1 símile de T. cruzi mostrou que esse domínio forma um homodímero que é característico das aspártico peptidases da família A2, e que cada monômero possui a sequência conservada Asp-Ser-Gly-Ala. O estudo de atração molecular (docking) mostrou uma diferente afinidade dos IPs-HIV pelo sítio ativo do domínio RVP da proteína, enquanto que pepstatina A e benzonidazol, controles positivo e negativo, apresentaram os melhores e piores índices de docking, respectivamente. Uma proteína heteróloga Ddi 1 símile foi expressa em Escherichia coli e purificada. A enzima purificada não apresentou atividade proteolítica contra substrato fluorogênico específico para Catepsina D, indicando que alterações estruturais importantes ocorreram na enzima heteróloga. O extrato total de E. coli, rico na proteína induzida, não foi capaz de degradar soro albumina bovina. Os IPs-HIV possuem ação tripanocida, porém o alvo intracelular e mecanismo de ação ainda não estão elucidados. Esse trabalho traz importantes contribuições para este campo, e abre perspectivas de explorar esta enzima para o desenho de novos fármacos, ou para modificações químicas nos IPs-HIV disponíveis para aumentar sua especificidade e potência. (AU)
Assuntos
Animais , Doença de Chagas , Tratamento Farmacológico , Doenças Negligenciadas , Reposicionamento de MedicamentosRESUMO
In the current study, we evaluated the mechanism of action of miltefosine, which is the first effective and safe oral treatment for visceral leishmaniasis, in Leishmania amazonensis promastigotes. Miltefosine induced a process of programmed cell death, which was determined by the externalization of phosphatidylserine, the incorporation of propidium iodide, cell-cycle arrest at the sub-G0/G1 phase and DNA fragmentation into oligonucleosome-sized fragments. Despite the intrinsic variation that is detected in Leishmania spp, our results indicate that miltefosine causes apoptosis-like death in L. amazonensis promastigote cells using a similar process that is observed in Leishmania donovani.