Monitoramento de norovírus e adenovírus em águas para consumo humano na cidade de Belém, Pará, Brasil, durante um período de cinco anos (2010 - 2015)

Os Norovírus (NoV) são responsáveis por grandes surtos de gastroenterite viral associada com alimentos e água contaminada, bem como os adenovírus humanos (HAdV) que também estão relacionados a doenças gástricas. Este estudo foi realizado no Parque Ambiental do Utinga, localizado na cidade de Belém, no estado do Pará, sendo que o mesmo contém uma Estação de Tratamento de Água (WTP-Bolonha) composta pelos lagos Bolonha e Água Preta. O Objetivo da presente investigação foi detectar o NoV e o HAdV em duas águas superficiais provenientes de mananciais (Bolonha e Água Preta) e em uma Estação de Tratamento de Água (ETA-Bolonha) em Belém, Pará, Brasil, de novembro de 2010 a dezembro de 2015. As amostras foram coletadas mensalmente nos três lugares, 62 amostras por ponto, em um total de 186. Dois litros de água foram concentrados em uma membrana filtrante, seguido de centrifugação, resultando em um volume final de 2 mL. O RNA extraído pelo método de sílica foi submetido à transcrição reversa para obter o cDNA. Para a detecção de NoV, foram realizadas a nested- PCR e semi-nested para genogroupos GI (COG1F / G1SKR) e GII (COG2F / G2SKR), respectivamente. Para o HAdV se utilizou o nested-PCR e os primers Hex1Deg / Hex2Deg e Hex3Deg / Hex4Deg na primeira e segunda etapa, respectivamente. Os tamanhos dos produtos (amplicons) obtidos nas amostras positivas foram: 171 pb (HAdV), 380 pb (No V GI) e 390 pb (NoV GII). NoV foi detectado em 3,8% (7/186) das águas testadas, sendo uma classificada como GI proveniente do lago Bolonha (1,6% -1/62) e três como GII obtidas no lago Água Preta e ETA (4,8 % -3/62, cada). HAdV foram observados em 29% (54/186) das águas analisadas, das quais 38,7% (24/62) foram oriundas do Lago Bolonha, 22,6% (14/62) do Lago Água Preta e 25,8 % (16/62) da ETA. Em 28% e 3,7% das amostras positivas para HAdV e NoV, respectivamente, apresentaram níveis de Escherichia coli aceitáveis pela legislação (CONAMA Nº 274/00). Das sete amostras positivas para NoV, três (42,9%) foram sequenciadas e classificadas como pertencentes ao genótipo GII.4, maior similaridade com a Sydney 2012 e USA 95/96. Das 54 amostras positivas para HAdV, 47 (87%) foram sequenciadas, sendo 22 correspondentes ao genótipo 41 (46,8%) e 10 ao genótipo 40 (21,3%), ambos do subgrupo F (68%); seis amostras pertenciam ao subgrupo A (12,7%), cinco ao subgrupo C (10,6%) e quatro ao subgrupo D (8,5%). Das 16 amostras positivas para HAdV que foram inoculadas em células HEP2-C e A549, 15 amplificaram após nested- PCR, das quais duas foram sequenciadas satisfatoriamente obtendo-se a espécie F, sorotipo 41, tanto na amostra de água utilizada como inóculo como a partir do cultivo celular. Os resultados obtidos demostram a presença de pelo menos um dos vírus investigados nos três locais estudados, utilizados para o abastecimento público de água. O NoV apresentou baixa detecção em relação ao HAdV, talvez devido um ser vírus de RNA e o outro DNA, o que daria maior estabilidade a partícula neste tipo de ambiente, caracterizado por ser água limpa, o que dificulta a sobrevivência desses vírus. Os genótipos 40 e 41 (subgrupo F) de HAdV foram os mais encontrados, estando relacionados com quadro de gastroenterite. Os resultados obtidos, reforçam a necessidade de um monitoramento contínuo desses vírus nesses locais.

Estudo da ocorrência de enterovirus (EV) humano como causa de infecção respiratória aguda (IRA) em pacientes atendidos na cidade de Belém, Pará, Brasil

Resumo: A infecção respiratória aguda (IRA) é uma das principais causas de morbidade e mortalidade no mundo. Os vírus respiratórios são os principais agentes causadores de IRA, sendo os Vírus influenza, Metapneumovírus humano, Orthopneumovírus humano, Rinovírus e Coronavírus os mais comuns, porém outros vírus, como os enterovírus, também possuem a capacidade de causar infecções no trato respiratório. Os enterovírus humanos pertencem ao gênero Enterovirus da família Picornaviridae, são vírus de transmissão predominantemente entérica, podem ser encontrados em todas as regiões do mundo e se apresentam como um dos agentes virais mais prevalentes entre os causadores de doenças em humanos. Infecções por estes agentes podem desencadear doenças neurológicas, no coração, músculos, pele e mucosas, além de infecções do trato respiratório superior (resfriados, laringite, faringite) e inferior (bronquite, pneumonia, bronquiolite). Neste contexto, objetivou-se detectar e caracterizar os enterovírus humanos provenientes de espécimes clínicos coletados de pacientes com IRA, atendidos em unidades de saúde da cidade de Belém, Pará no período de janeiro a dezembro de 2015. A população de estudo compreendeu 274 indivíduos de ambos os sexos em diferentes faixas etárias, com queixas de infecção respiratória aguda. A detecção e caracterização genética dos entrovírus foram realizadas em 5 etapas principais: a) extração do RNA viral; b) Amplificação do RNAv pela técnica de reação em cadeia mediada pela polimerase precedida de transcrição reversa em tempo real; c) Isolamento em cultivo celular; d) Semi Nested - reação em cadeia mediada pela polimerase precedida de transcrição reversa; e) Sequenciamento parcial da região VP1. Foi identificado, por meio de isolamento viral e caracterização molecular, o coxsackievírus B2 como causa de infecção respiratória aguda em um (0,36%) paciente pediátrico, com 1 ano de idade, do sexo feminino. Ela apresentava sete dias de sintomas leves, sem nenhuma comorbidade ou fator de risco, a coleta de seu espécime foi realizada no mês de maio, justamente no período do ano em que houve maior ocorrência de IRA na região. Este é um achado pioneiro, consistindo no primeiro relato do coxsackievírus B2 associado à infecção respiratória em nosso país. A partir dos dados apresentados, é notória a necessidade de realização de outros estudos que visem elucidar se há ou não a circulação de outros enterovírus não só na cidade de Belém, mas no Brasil como um todo, frente ao potencial destes vírus em induzir casos graves de infecção respiratória.

Detecção, viabilidade e genotipagem de enterovírus e rotavírus A em águas superficiais da Ilha de Mosqueiro, Belém, Pará, Brasil, no período de 2012 a 2014

Resumo: Os vírus entéricos são a principal causa de doenças transmitidas pela água. Estes agentes estão presentes em grandes quantidades nas fezes de indivíduos infectados, permanecendo viáveis e infecciosos por meses no ambiente e podem contaminar a água usada para consumo e recreação. Seu monitoramento é necessário pois os indicadores bacteriológicos utilizados para avaliar a qualidade da água não possuem relação com a contaminação viral. Além disso, alguns patógenos transmitidos pela água são fastidiosos, como os enterovírus (EV) e rotavírus grupo A (RVA). O objetivo deste estudo foi detectar os EV e RVA em amostras de água superficial de quatro praias (Paraíso, Murubira, Farol e Areião) localizadas na ilha de Mosqueiro, Belém, Brasil. As amostras de água foram coletadas mensalmente no período de janeiro/2012 a dezembro/2014, com exceção de julho quando houve coletas quinzenais. Dois litros de água foram concentradas pelo método de adsorção-eluição em membrana filtrante, seguido de centrifugação para obter volume final de 2 ml. O ARN foi obtido utilizando extração pela sílica. Foi empregado o semi-nested PCR com iniciadores P2, P3 e P10 para a detecção dos EV e o nested PCR usando os iniciadores VP6F, VP6R, VP6NF e VP6NR para RVA. A positividade obtida para EV e RVA nas praias da ilha de Mosqueiro foi de 28,2% (44/156), sendo 25 % (11/44) correspondente aos EV, 56,8 % (25/44) aos RVA e 18,2% (8/44) para ambos os vírus. Esses vírus foram detectados em todas as areas de estudo, com maior positividade na praia do Paraíso (33,3%). A maior positividade ocorreu na preamar. Um total de 26,5% (39/147) das amostras com concentração aceitável (<2000) para a presença de E. coli foram positivas para EV e/ou RVA. Duas amostras de RVA apresentaram infectividade quando submetidas ao cultivo celular. Após análise filogenética para EV, 63,2% (12/19) foram classificadas como enterovírus não pólio, 15,8% (3/19) como pólio 1 vacinal e em 21% (4/19) a sequência obtida não apresentou qualidade suficiente para análise. Estas praias estão contaminadas por galerias de esgoto que fluem diretamente nas mesmas, contribuindo com a sua contaminação, e, consequentemente, expondo as pessoas que usam esses lugares para recreação, principalmente crianças suscetíveis. Estes vírus são de grande relevância em termos de saúde pública e ambiental, pois eles têm um enorme potencial de disseminação devido sua prolongada manutenção no ambiente.

Detecção e genotipagem de norovírus em sangue e fezes de crianças hospitalizadas com quadro de gastrenterite em Belém, Pará, Brasil

Resumo: As doenças diarréicas agudas acometem anualmente milhões de indivíduos e ainda constituem uma das cinco principais causas de morte entre crianças menores de cinco anos. A gastrenterite aguda (GA) possui diversos agentes etiológicos, entretanto, recentemente os vírus vêm sendo identificados como responsáveis por cerca de 70% do total de casos. Dentre estes, destaca-se o norovírus (NoV), um dos principais responsáveis por casos esporádicos e surtos de GA. Este vírus é normalmente excretado nas fezes dos pacientes, em grande quantidade, o que facilita sua disseminação e novas contaminações. Mais recentemente o NoV foi detectado também no soro de pacientes com sintomas extra-intestinais, como: coagulação intravascular disseminada, enterocolite necrosante e convulsões. Logo, o objetivo desta pesquisa foi investigar a presença de NoV no soro de crianças hospitalizadas com quadro de GA que apresentavam o vírus nas fezes e correlacionar este achado com o quadro clínico apresentado pelo paciente. De março/2012 a junho/2015, foram obtidos dados clínicos e amostras de fezes/ soro de crianças com até nove anos de idade, hospitalizadas por GA em duas clínicas pediátricas de Belém, Pará, Brasil. Para a detecção de NoV nas amostras fecais utilizou-se o ensaio imunoenzimático (EIE) (kit RIDASCREEN®), e no soro a técnica de reação em cadeia da polimerase quantitativa precedida de transcrição reversa (RT-qPCR), sistema TaqMan, iniciadores COG2F e COG2R, sonda RING-2 e uma curva-padrão plasmidial. As amostras positivas foram submetidas à reação em cadeia da polimerase precedida de transcrição reversa (RT-PCR) com iniciadores específicos para a região do capsídeo ou da junção entre a polimerase e o capsídeo, visando o sequenciamento parcial do genoma viral. Amostras com suspeita de recombinação foram analisadas por meio do programa Simplot. Os dados clínicos foram tratados estatisticamente, utilizando os testes do qui-quadrado e de Mann-whitney. Uma positividade de 24,3% (108/445) foi obtida para NoV nas amostras fecais, dentre as quais 20,4% (22/108) também foram positivas nos soros. A carga viral fecal foi maior no grupo de crianças que também apresentou o vírus no soro em comparação ao que tinha o vírus apenas nas fezes (p<0,0001), sendo este mesmo padrão observado com relação ao tempo de hospitalização (p= 0,0252). A faixa etária de 0 a 36 meses foi a mais acometida por NoV em relação as fezes, enquanto que no soro foi entre >6 até 24 meses, havendo diminuição no número de casos em ambos os grupos conforme o aumento da idade (p=0,0059; p=0,0211). Foram encontrados nove diferentes genótipos do genogrupo GII sendo deles três cepas recombinantes (GII.2, GII.4, GII.6, GII.7, GII.8, GII.17, GII.P6/GII.7, GII.P22/GII.5 e GII.P13/GII.17) e dois do genogrupo GI, sendo um recombinante (GI.2 e GI.Pb/GI.6). O GII.4 variante Sydney foi o prevalente. Nesses três anos de pesquisa, verificou-se que os NoV foram responsáveis por quase 1/4 dos casos de GA entre as crianças hospitalizadas, dentre as quais a circulação do RNA viral nos soros foi expressiva, considerando outros estudos já realizados, e influenciou o tempo de hospitalização destas crianças. Além disso, observou-se ampla diversidade genética, o que contribui para estudos futuros visando uma vacina preventiva.

Detecção e genotipagem de adenovírus humano em águas destinadas à recreação, provenientes da Ilha de Mosqueiro, região metropolitana de Belém, Estado do Pará, Brasil, janeiro de 2012 a dezembro de 2014

A Ilha de Mosqueiro é o principal balneário da cidade de Belém e, embora receba um grande contingente populacional em suas praias durante todo o ano, não apresenta estações de tratamento de esgoto e águas pluviais que garantam a segurança da saúde de seus veranistas e dos moradores efetivos. A fim de se detectar a presença de HAdV em águas destinadas à recreação, foram coletadas, mensalmente, com exceção de julho que ocorreu quinzenalmente, águas de quatro praias (Paraíso, Murubira, Farol e Areião) situadas ao longo da costa da ilha, durante janeiro de 2012 a dezembro de 2014. As amostras foram concentradas pelo método de adsorção-eluição em membrana filtrante; em seguida, o DNA foi extraído pelo método da sílica e então submetido a nested-PCR. Os produtos positivos foram purificados utilizando-se o kit Mega Quick-spin total® (Intron Biotechnology) e sequenciados com o uso do Kit BigDye® Terminator v3.1 Cycle Sequencing (Life Technologies) e da plataforma 3130xL Genetic Analyzer (Applied Biosystems). Os dados ambientais foram obtidos por meio de consulta ao Centro de Hidrografia da Marinha (CHM) e Instituto Nacional de Meteorologia (INMET), disponíveis eletronicamente, considerando o dia e horário de coletas. Para isolamento viral foi utilizada a linhagem A549 (Carcinoma de pulmão humano), a fim de constatar a infecciosidade viral em algumas amostras de praias que apresentaram resultado positivo para HAdV. Do total de 156 amostras coletadas, 34 (21,8%) foram positivas para HAdV por nested-PCR, sendo as mesmas detectadas em todo o período estudado, não sendo possível observar um padrão sazonal. Dessas, 24 (70,5%) foram sequenciadas, sendo 20 (83,3%) caracterizadas como espécie F (16-80% como ad-41 e 4- 20% ad-40), duas com a espécie C, uma como espécie A e uma amostra que apresentou similaridade com adenovírus símio (SAdV). A precipitação pluviométria aparentemente não influenciou na detecção dos HAdV, mas o mesmo não ocorreu em relação à ação das marés, pois a maior detecção viral ocorreu em preamar, provavelmente devido ao carreamento de patógenos ambientais. Quatro amostras submetidas ao cultivo celular demonstraram efeito citopático (ECP), indicando que os HAdVs detectados nas águas recreativas da região metropolitana de Belém possuíam capacidade infectiva, logo apresentavam risco à saúde dos banhistas e frequentadores locais. Não foi observada relação entre bactérias coliformes (Escherichia coli) e HadV, visto que a presença viral foi confirmada em 21,1% (31/147) das amostras, cuja concentração de bactérias estava de acordo com os padrões vigentes (<2000). Este estudo demonstrou a presença de HAdV em praias de água doce, além de evidenciar o padrão de circulação de HAdV, até então desconhecido nessa região em ambientes destinados ao lazer. Alem disso, reforça a importância da análise virológica juntamente com a dos indicadores bacterianos atualmente usados e sobre a necessidade de maiores estudos na avaliação dos riscos à saúde pública por este e outros vírus.