Affordable de novo generation of fish mitogenomes using amplification-free enrichment of mitochondrial DNA and deep sequencing of long fragments.

RESUMEN

Los estudios de biomonitoreo utilizan herramientas de caracterización genética (metabarcoding) para describir la composición de la comunidad. Estos estudios contrastan las secuencias obtenidas con bases de datos genómicas públicas para así identificar la especie. Sin embargo, las bases de datos mitocondriales de referencia distan mucho de estar completas. En la mayor parte de los casos solo hay unos pocos genes disponibles o los datos existentes no ofrecen resolución hasta el nivel de especie. En este estudio presentamos un método dedicado a generar mitogenomas de peces completos de forma rentable y sin necesidad de amplificación del ADN, con el objeto de ampliar las bases de datos mitocondriales de peces. Para ello se utilizaron dos enfoques diferentes de secuenciación de fragmentos largos utilizando secuenciación Oxford Nanopore y enriquecimiento de ADN mitocondrial. Uno en el que el enriquecimiento se logra mediante el aislamiento preferencial de mitocondrias seguido de extracción del ADN y la eliminación del ADN nuclear ("mitoenriquecimiento"). En el segundo enfoque se aprovecha la capacidad de escisión dirigida por la endonucleasa CRISPR-Cas9 sobre ADN previamente desfosforilado ("mitosecuenciación dirigida"). Los resultados difirieron con el tejido, la especie y la integridad del ADN. El método de mitoenriquecimiento produjo un 0,17%-12,33% de secuencias objetivo y una cobertura media entre 74,9 y 805 secuencias. El experimento de mitosecuenciación dirigida a partir de ADN genómico nativo produjo entre 1,83 y 55% de secuencias objetivo y una cobertura media de 38 a 2123 secuencias. Este estudio permitió completar mitogenomas de diferentes especies que incluyen regiones homopoliméricas, repeticiones en tándem y reorganización de genes. Demostramos que la secuenciación intensiva de fragmentos largos de ADN de peces es posible, se puede lograr con bajos recursos informáticos de una manera económica, superando el método generalizado de secuenciación genómica de baja cobertura y permitiendo el descubrimiento de mitogenomas de taxones de peces no modelo o poco estudiados a una amplia gama de laboratorios en todo el mundo.