Effects of cholinergic stimulation with pyridostigmine bromide on chronic chagasic cardiomyopathic mice.

The aim of the present study was to assess the effects of an anticholinesterase agent, pyridostigmine bromide (Pyrido), on experimental chronic Chagas heart disease in mice. To this end, male C57BL/6J mice noninfected (control:Con) or chronically infected (5 months) with Trypanosoma cruzi (chagasic:Chg) were treated or not (NT) with Pyrido for one month. At the end of this period, electrocardiogram (ECG); cardiac autonomic function; heart histopathology; serum cytokines; and the presence of blood and tissue parasites by means of immunohistochemistry and PCR were assessed. In NT-Chg mice, significant changes in the electrocardiographic, autonomic, and cardiac histopathological profiles were observed confirming a chronic inflammatory response. Treatment with Pyrido in Chagasic mice caused a significant reduction of myocardial inflammatory infiltration, fibrosis, and hypertrophy, which was accompanied by a decrease in serum levels of IFNγ with no change in IL-10 levels, suggesting a shift of immune response toward an anti-inflammatory profile. Lower nondifferent numbers of parasite DNA copies were observed in both treated and nontreated chagasic mice. In conclusion, our findings confirm the marked neuroimmunomodulatory role played by the parasympathetic autonomic nervous system in the evolution of the inflammatory-immune response to T. cruzi during experimental chronic Chagas heart disease in mice.

Validation of the NAT Chagas IVD Kit for the Detection and Quantification of Trypanosoma cruzi in Blood Samples of Patients with Chagas Disease.

In the absence of validated biomarkers to control the cure of Chagas disease, PCR-based diagnosis is being used as the main tool for an early indication of therapeutic failure. However, since it is considered a technique of complex reproducibility, mainly due to difficulties in establishing accurate controls to guarantee the quality of the reaction, the use of PCR for Chagas disease diagnosis is restricted to specialized centers. In an effort to disseminate the molecular diagnosis of Chagas disease and its applications, new diagnostic kits based on qPCR have been made available in the market in recent years. Here, we show the results of the validation of the NAT Chagas kit (Nucleic Acid Test for Chagas Disease) for the detection and quantification of T. cruzi in blood samples of patients suspected of Chagas disease infection. The kit, composed of a TaqMan duplex reaction targeting the T. cruzi satellite nuclear DNA and an exogenous internal amplification control, presented a reportable range from 104 to 0.5 parasite equivalents/mL and a limit of detection (LOD) of 0.16 parasite equivalents/mL of blood. In addition, the NAT Chagas kit detected T. cruzi belonging to all six discrete typing units (DTUs-TcI to TcVI), similarly to the in-house real-time PCR performed with commercial reagents, which has been selected as the best performance assay in the international consensus for the validation of qPCR for Chagas disease. In the clinical validation presented here, the kit showed 100% sensitivity and 100% specificity when compared to the consensus in-house real-time PCR assay. Thus, the NAT Chagas kit, which is produced entirely in Brazil under the international standards of good manufacturing practices (GMP), appears as an excellent alternative to enable the molecular diagnosis of Chagas disease in public and private diagnostic centers, as well as to facilitate the monitoring of patients under etiological treatment participating in clinical trials.

Análise da expressão do gene TcNTPDase-1 em diferentes subpopulações e formas evolutivas de Trypanosoma cruzi

A doença de Chagas é uma doença negligenciada causada pelo protozoário parasita Trypanosoma cruzi, o qual afeta cerca de 6-8 milhões de pessoas em áreas endêmicas da América Latina. As diferentes cepas envolvidas na infecção, e sua distribuição regional, tem sido sugeridas como causa das diferentes manifestações clínicas, resposta ao diagnóstico e eficácia terapêutica. A ecto-NTPDase é uma enzima localizada na superfície externa da membrana plasmática do T.cruzi, que hidrolisa nucleotídeos tri e difosfatados. Estudos anteriores têm relacionado esta enzima à infectividade e virulência de tripanosomatídeos, além de sugerir um papel importante na captação de purinas pelos parasitos. Neste trabalho avaliamos os níveis de mRNA para a TcNTPDase-1 por RT-PCR, em diferentes isolados do parasito (Dm28c- T.cruzi I; Y- T.cruzi II; 3663- T.cruzi III; 4167- T.cruzi IV; LL014- T.cruzi V; CL-14- T.cruzi VI- avirulenta), em formas não-infectantes (epimastigotas) e infectantes (tripomastigotas e amastigotas). Os ensaios de PCR em Tempo Real foram realizados com oligonucleotídeos desenhados para amplificar uma sequência de 111pb do gene TcNTPDase-1 e, como controles endógenos, uma sequência de 268pb do gene da TcCalmodulina e uma sequência de 100pb do gene TcGAPDH foram utilizados. Nós observamos que epimastigotas das cepas Y, 3663, 4167 e LL014 apresentaram os mesmos níveis de expressão do gene TcNTPDase-1 que o clone CL-14, avirulento Por outro lado, o clone Dm28c expressou 7,2\F0B11,5 vezes mais o gene desta enzima que o clone CL-14. Além disso, observamos que as formas infectantes tripomastigota e amastigota apresentaram, respectivamente, uma expressão 22,5\F0B15,6 e 16,3\F0B13,8 vezes maior que a forma epimastigota. Observamos também que durante a curva de crescimento de formas epimastigotas a 28°C e 37°C a expressão deste gene aumenta gradativamente com o tempo de cultivo, sendo mais pronunciado a 37°C, sugerindo que o choque-térmico e o longo período de cultivo pode aumentar a expressão do gene da TcNTPDase-1. Em conjunto, nossos dados sugerem que a TcNTPDase-1 estaria envolvida nos processos de infectividade do T.cruzi, bem como adaptação do parasita a temperatura do hospedeiro vertebrado. Devido sua importância para o T.cruzi, a TcNTPDase-1 apresenta potencial para ser avaliada como possível alvo para quimioterapia da Doença de Chagas

Análise da expressão do gene TcNTPDase-1 em diferentes subpopulações e formas evolutivas de Trypanosoma cruzi / Gene expression analysis of tcntpdase-1 in the distinct subpopulation and evolutive forms of trypanosoma cruzi

A doença de Chagas é uma doença negligenciada causada pelo protozoário parasita Trypanosoma cruzi, o qual afeta cerca de 6-8 milhões de pessoas em áreasendêmicas da América Latina. As diferentes cepas envolvidas na infecção, e suadistribuição regional, tem sido sugeridas como causa das diferentes manifestaçõesclínicas, resposta ao diagnóstico e eficácia terapêutica. A ecto-NTPDase é umaenzima localizada na superfície externa da membrana plasmática do T.cruzi, quehidrolisa nucleotídeos tri e difosfatados. Estudos anteriores têm relacionado estaenzima à infectividade e virulência de tripanosomatídeos, além de sugerir um papelimportante na captação de purinas pelos parasitos. Neste trabalho avaliamos osníveis de mRNA para a TcNTPDase-1 por RT-PCR, em diferentes isolados doparasito (Dm28c- T.cruzi I; Y- T.cruzi II; 3663- T.cruzi III; 4167- T.cruzi IV; LL014-T.cruzi V; CL-14- T.cruzi VI- avirulenta), em formas não-infectantes (epimastigotas) einfectantes (tripomastigotas e amastigotas). Os ensaios de PCR em Tempo Realforam realizados com oligonucleotídeos desenhados para amplificar uma sequênciade 111pb do gene TcNTPDase-1 e, como controles endógenos, uma sequência de268pb do gene da TcCalmodulina e uma sequência de 100pb do gene TcGAPDHforam utilizados. Nós observamos que epimastigotas das cepas Y, 3663, 4167 eLL014 apresentaram os mesmos níveis de expressão do gene TcNTPDase-1 que oclone CL-14, avirulento.

Por outro lado, o clone Dm28c expressou 7,2 +/- 1,5 vezes mais o gene desta enzima que o clone CL-14. Além disso, observamos que as formas infectantes tripomastigota e amastigota apresentaram, respectivamente, uma expressão 22,5 +/- 5,6 e 16,3 +/- 3,8 vezes maior que a forma epimastigota. Observamos também que durante a curva de crescimento de formas epimastigotas a 28°C e 37°Ca expressão deste gene aumenta gradativamente com o tempo de cultivo, sendo mais pronunciado a 37°C, sugerindo que o choque-térmico e o longo período de cultivo pode aumentar a expressão do gene da TcNTPDase-1. Em conjunto, nossos dados sugerem que a TcNTPDase-1 estaria envolvida nos processos de infectividade do T.cruzi, bem como adaptação do parasita a temperatura do hospedeiro vertebrado. Devido sua importância para o T.cruzi, a TcNTPDase-1 apresenta potencial para ser avaliada como possível alvo para quimioterapia da Doença de Chagas. (AU)

Chagas disease is a neglected illness caused by the parasite protozoanTrypanosoma cruzi, which affects 6-8 million people in endemic areas of LatinAmerica. The distinct strains involved in infection, in conjunction with the regionaldistribution, have been suggested to cause different clinical manifestations andtherapeutic efficiency in Chagas Disease. The ecto-NTPDase is an apyrase locatedon the outer surface of T.cruzi plasma membrane- that hydrolyzes tri- and/or diphosphatenucleotides. Previous studies related this enzyme to the infectivity andvirulence of the parasite, and suggest an important role in the uptake of purines. Inthis study, we evaluate the mRNA levels for the ecto-NTPDase I by RT-PCR indistinct isolated parasites (Dm28c- T.cruzi I; Y- T.cruzi II; 3663- T.cruzi III; 4167-T.cruzi IV; LL014- T.cruzi V; CL-14- T.cruzi VI- avirulent), in non-infective forms(epimastigotes) and infective forms (amastigotes and trypomastigotes). The RealTime PCR assays were performed with primers designed to amplify a 111bpsequence in the TcNTPDase-1 gene and, as endogenous controls, a 268bpsequence in the TcCalmoduline gene and a 100bp sequence in the TcGAPDH genewere used. We observed that the epimastigotes of strains Y, 3663, 4167 e LL014expressed the same levels of the gene of TcNTPDase-1 that the CL-14 clone,avirulent.

On the other hand, the Dm28c clone expressed 7.2 +/- 1.5 times higher thegene of this enzyme that the CL-14 clone. Surprisingly, we observed that thetrypomastigote and amastigote presented expression levels, respectively, 22.5 +/- 5.6and 16.3 +/- 3.8 times higher than the epimastigote form. Moreover, following theepimastigotes growth curve at 28°C e 37°C, we also observed that the expression ofTcNTPDase-1 increases with the days of growth, and this increase is morepronounced at 37°C, suggesting that heat shock and long-term cultivation couldincrease TcNTPDase-1 gene expression. In conjunction, our results suggest the roleof TcNTPDase-1 on T.cruzi infectivity and adjustment to stress conditions such asnutrients starvation and heat shock. Due to its importance for T.cruzi, TcNTPDase-1has the potential to be evaluated as a possible target for chemotherapy of ChagasDisease. (AU)

Análise da expressão do gene TcNTPDase-1 em diferentes subpopulações e formas evolutivas de Trypanosoma cruzi / Gene expression analysis of tcntpdase-1 in the distinct subpopulation and evolutive forms of trypanosoma cruzi

A doença de Chagas é uma doença negligenciada causada pelo protozoßrio parasita Trypanosoma cruzi, o qual afeta cerca de 6-8 milhões de pessoas em ßreasendêmicas da América Latina. As diferentes cepas envolvidas na infecção, e suadistribuição regional, tem sido sugeridas como causa das diferentes manifestaçõesclínicas, resposta ao diagnóstico e eficßcia terapêutica. A ecto-NTPDase é umaenzima localizada na superfície externa da membrana plasmßtica do T.cruzi, quehidrolisa nucleotídeos tri e difosfatados. Estudos anteriores têm relacionado estaenzima à infectividade e virulência de tripanosomatídeos, além de sugerir um papelimportante na captação de purinas pelos parasitos. Neste trabalho avaliamos osníveis de mRNA para a TcNTPDase-1 por RT-PCR, em diferentes isolados doparasito (Dm28c- T.cruzi I; Y- T.cruzi II; 3663- T.cruzi III; 4167- T.cruzi IV; LL014-T.cruzi V; CL-14- T.cruzi VI- avirulenta), em formas não-infectantes (epimastigotas) einfectantes (tripomastigotas e amastigotas). Os ensaios de PCR em Tempo Realforam realizados com oligonucleotídeos desenhados para amplificar uma sequênciade 111pb do gene TcNTPDase-1 e, como controles endógenos, uma sequência de268pb do gene da TcCalmodulina e uma sequência de 100pb do gene TcGAPDHforam utilizados. Nós observamos que epimastigotas das cepas Y, 3663, 4167 eLL014 apresentaram os mesmos níveis de expressão do gene TcNTPDase-1 que oclone CL-14, avirulento...

Chagas disease is a neglected illness caused by the parasite protozoanTrypanosoma cruzi, which affects 6-8 million people in endemic areas of LatinAmerica. The distinct strains involved in infection, in conjunction with the regionaldistribution, have been suggested to cause different clinical manifestations andtherapeutic efficiency in Chagas Disease. The ecto-NTPDase is an apyrase locatedon the outer surface of T.cruzi plasma membrane- that hydrolyzes tri- and/or diphosphatenucleotides. Previous studies related this enzyme to the infectivity andvirulence of the parasite, and suggest an important role in the uptake of purines. Inthis study, we evaluate the mRNA levels for the ecto-NTPDase I by RT-PCR indistinct isolated parasites (Dm28c- T.cruzi I; Y- T.cruzi II; 3663- T.cruzi III; 4167-T.cruzi IV; LL014- T.cruzi V; CL-14- T.cruzi VI- avirulent), in non-infective forms(epimastigotes) and infective forms (amastigotes and trypomastigotes). The RealTime PCR assays were performed with primers designed to amplify a 111bpsequence in the TcNTPDase-1 gene and, as endogenous controls, a 268bpsequence in the TcCalmoduline gene and a 100bp sequence in the TcGAPDH genewere used. We observed that the epimastigotes of strains Y, 3663, 4167 e LL014expressed the same levels of the gene of TcNTPDase-1 that the CL-14 clone,avirulent...