Ácido fólico em excesso: efeitos sobre o metabolismo das vitaminas B2 e B6, o catabolismo do triptofano e a resposta imune / Folic acid excess: effects on vitamin B2 and B6 metabolism, tryptophan catabolism and immune response

Introdução: A suplementação com ácido fólico (AF) é recomendada em algumas condições para evitar a deficiência de folato, como para mulheres no período periconcepcional e durante a gestação. Atualmente, existe uma preocupação quanto ao consumo excessivo de AF pela população pelo uso de suplementos com altas doses dessa vitamina. As vitaminas B6 e B2 agem como cofatores no metabolismo de um carbono, e o uso de altas doses de AF pode influenciar o metabolismo de ambas vitaminas e, consequentemente, interferir em metabolismos importantes das quais elas participam, como a via das quinureninas, e no sistema imune. Objetivo: Avaliar os efeitos da intervenção diária com uma alta dose de AF (5 mg) por 90 dias sobre marcadores do estado das vitaminas do complexo B, e as consequências sobre os metabólitos da via das quinureninas e o sistema imune em adultos saudáveis. Material e Métodos: 64 indivíduos saudáveis foram submetidos à intervenção diária com 5 mg de AF por 90 dias. Coletas de sangue foram realizadas antes (baseline) e após 45 e 90 dias de intervenção. As concentrações séricas de folato e vitamina B12 foram avaliadas por métodos microbiológicos. As concentrações séricas das vitaminas B6 (piridoxal 5'-fosfato (PLP), piridoxal (PL) e ácido 4-piridóxico (PA)), B2 (riboflavina e flavina mononucleotídeo (FMN)), B1 (tiamina e tiamina monofosfato (TMP)) e B3 (ácido nicotínico, nicotinamida e N1-metilnicotinamida), bem como de triptofano, quinurenina e metabólitos, foram avaliadas por LC-MS/MS. A proteína C-reativa ultrassensível (PCRus) foi determinada por imunoturbidimetria, e as concentrações séricas de interleucina (IL)-6, IL-8, IL-10, interferon gama (IFN-γ) e fator de necrose tumoral alfa (TNF-α) foram avaliadas por ensaio multiplex. A expressão de RNAm de DHFR (dihidrofolato redutase), MTHFR (metilenotetrahidrofolato redutase), IL8, TNFA e IFNG em leucócitos mononucleares (PBMC) foram avaliadas por PCR em tempo real. O número de células T regulatórias (Treg) (CD3+, CD4+, CD25high, FoxP3+, CD127-) foi avaliado após incubação dos PBMC com PMA e ionomicina ou veículo por 18h, por imunofenotipagem. Resultados: Houve um grande aumento das concentrações de folato sérico após 45 e 90 dias de intervenção com AF. Não houve diferença nas concentrações de vitamina B12 antes e após a intervenção. As concentrações séricas de PLP foram semelhantes antes e após a intervenção, entretanto, um aumento de PL sérico foi observado após 45 e 90 dias, e de PA após 45 dias, quando comparado ao baseline. Riboflavina e FMN foram maiores após 45 e 90 dias em relação ao baseline. A tiamina sérica foi menor após 45 dias, e as concentrações de TMP foram maiores após 90 dias quando comparados aos períodos anteriores. Não houve diferença nas concentrações de vitamina B3 antes e após a intervenção. Dentre os metabólitos da via das quinureninas, apenas o ácido antranílico apresentou aumento após 45 e 90 dias, enquanto o ácido picolínico diminuiu após 90 dias. PCRus, IL-6, IL-8, IL-10, IFN-γ e TNF-α séricos foram semelhantes no baseline e após a intervenção. Um aumento da expressão de RNAm de DHFR e TNFA foi observado após, respectivamente, 90 dias e 45 e 90 dias de intervenção. Após 90 dias de intervenção com AF, foi observada diminuição do número de células Treg após estímulo com PMA e ionomicina. Conclusão: O uso diário de 5 mg de AF foi associado a alterações nas concentrações séricas de marcadores do estado de vitaminas do complexo B e da via das quinureninas, bem como a diminuição do número de células Treg

Introduction: Folic acid (FA) supplementation is recommended in some conditions to avoid folate deficiency, as women during periconceptional period and pregnancy. Currently, there is a concern about the excessive consumption of FA by population by using supplements with high doses of this vitamin. Vitamins B6 and B2 are cofactors of enzymes of one carbon metabolism and, consequently, may disturb key metabolism in which they participate, as kynurenine pathway, and the immune system. Aim: To assess the effects of a daily intervention with high dose of FA (5 mg) for 90 days on biomarkers of complex B vitamins status and its outcomes in kynurenine pathway metabolites and immune system in healthy adults. Material and Methods: 64 healthy individuals were submitted to a daily intervention with 5 mg of FA for 90 days. Blood samples were collected before (baseline) and after 45 and 90 days of intervention. Serum folate and vitamin B12 were assessed by microbiological assays. Serum vitamin B6 (pyridoxal 5'-phosphate (PLP), pyridoxal (PL) and 4-pyridoxic acid (PA)), vitamin B2 (riboflavin and flavin mononucleotide (FMN)), vitamin B1 (thiamin and thiamin monophosphate)) and vitamin B3 (nicotinic acid, nicotinamide and N1-methylnicotinamide), as well as tryptophan, kynurenine and metabolites, were assessed by LC-MS/MS. C-reactive protein (hs-CPR) was assessed by immunoturbidimetry, and serum interleukin (IL)-6, IL-8, IL-10, interferon gamma (IFN-γ) and tumor necrosis factor alpha (TNF-α) were assessed by multiplex assay. Mononuclear leukocytes mRNA expression of DHFR (dihydrofolate reductase), MTHFR (methylenetetrahydrofolate reductase), IL8, TNFA and IFNG were assessed by real time PCR. Regulatory T Cell (Treg) number (CD3+, CD4+, CD25high, FoxP3+, CD127-) was determined after mononuclear leukocytes incubation with PMA and ionomycin or vehicle for 18h, by immunophenotyping. Results: A great increase on serum folate was observed after 45 and 90 days of FA intervention. No differences in serum vitamin B12 were observed before and after intervention. Serum PLP was similar before and after intervention, however, an increase in serum PL was observed after 45 and 90 days, and in PA after 45 days, when compared to baseline. Riboflavin and FMN were increased after 45 and 90 days than in baseline. Serum thiamine was decreased after 45 days than in baseline. Serum TMP was increased after 90 days when compared with previous timepoints. No differences in vitamin B3 were observed after and before FA intervention. Among kynurenine pathway metabolites, anthranilic acid was increased after 45 and 90 days, while picolinic acid was decreased after 90 days. hs-CPR, serum IL-6, IL-8, IL-10, IFN-γ and TNF-α were similar at baseline and after intervention. An increase on mRNA expression of DHFR and TNFA was observed after, respectively, 90 days and 45 and 90 days of intervention. After 90 days of FA intervention, it was observed a decrease on Treg cell number after PMA and ionomycin stimulation. Conclusion: Daily use of 5 mg of FA was associated with changes in serum markers of B-complex vitamins status and kynurenine pathway, as well as decreased number of Treg cells

Rol de las células T regulatorias en esclerosis múltiple / Role of T-regulatory cells in multiple sclerosis

La esclerosis múltiple (EM) es una enfermedad inflamatoria autoinmune desmielinizante del sistema nervioso central (SNC). La mayoría de las enfermedades autoinmunes se originan por la activación anormal de la respuesta inflamatoria contra auto-antígenos (la mayoría de ellos desconocidos a la fecha) como consecuencia de la pérdida de la tolerancia periférica. Las células T-regulatorias constituyen un grupo esencial de linfocitos T encargados del mantenimiento de la tolerancia periférica, la prevención de enfermedades autoinmunes y la limitación de enfermedades inflamatorias crónicas. Teniendo en cuenta la importancia de la tolerancia periférica, las células T-regulatorias serían componentes cruciales en el escenario fisiopatológico de los procesos autoinmunes, incluyendo la EM. El presente trabajo recopila los conocimientos actuales sobre la función de las células T-regulatorias en la EM, la enfermedad autoinmune desmielinizante del SNC más prevalente en los seres humanos.

Multiple sclerosis (MS) is an autoimmune inflammatory demyelinating disease of the central nervous system (CNS). Most of autoimmune diseases arise by an abnormal activation of the inflammatory response against self-antigens (most of them unknown up to date) as a consequence of dysfunction in peripheral tolerance. Regulatory T-cells are essential for maintaining peripheral tolerance, preventing autoimmune diseases and limiting chronic inflammatory conditions. Based on that knowledge, T-regulatory cells have emerged as a key component of the physiopathology of autoimmune diseases including MS. This review compiles the current knowledge on the role and function of T-regulatory cells in MS, the most prevalent CNS autoimmune disease in humans.

Participação das células T de memória e linfócitos CD4.CD25+Foxp3 (reguladores) nos mecanismos de resistência à infecção experimental pelo trypanosoma cruzi

A infecção pelo Trypanosoma cruzi (T. cruzi) resulta em uma resposta imune que controla a predominância do parasito, mas é incapaz de eliminá-lo completamente, levando a persistência do parasito. A gravidade da doença de Chagas está correlacionada com a persistência do parasito nos tecidos musculares, neurais e intestinais. A função imunorregulatória das células T reguladoras em limitar a resposta imune poderia ser explorada no sentido de erificar a sua quantidade e qualidade no modelo experimental de infecção por T. cruzi. O principal objetivo deste projeto foi estudar a participação e influência dos linfócitos Treg sobre os mecanismos de resistência a infecção por T. cruzi, principalmente sobre a geração/manutenção de células T CD4+ e CD8+ memória efetora e central. Para tal, foi realizado um estudo comparativo da importância dos linfócitos T, e alterações das células Treg na infecção experimental por T. cruzi, de animais susceptíveis (C57Bl/6) e resistentes (BALB/c) nos dias 10, 20 e 30 apos a infecção. Adicionalmente, com o objetivo de investigar o papel das células T reguladoras, foi realizada a neutralização da citocina IL-2, com o tratamento in vivo com anti-IL-2 monoclonal (clone JES6-1A12), em animais C57Bl/6, durante a infecção com a cepa Tulahuen de T. cruzi. A análise da cinética de infecção (10, 20 e 30 dias) revelou que os animais resistentes (BALB/c) apresentaram maior expansão de células T efetoras CD4+ e CD8+ no baço e no tecido muscular esquelético. Os dados coletados demonstram que o tratamento com anti-IL-2 resultou em diminuição significativa da população de células T CD4+CD25+Foxp3+ nos animais infectados, comparado ao grupo infectado e tratado com imunoglobulina de rato. A diminuição das células Treg nestes animais resultou em alterações importantes nos mecanismos efetores como, por exemplo: o aumento da expansão das células T CD4+ e CD8+ efetoras e a produção de citocinas pró-inflamatórias e anti-inflamatórias no baço e tecido muscular esquelético. O reflexo destas alterações foi relacionado à diminuição da parasitemia e da mortalidade dos animais. Desta forma, as células Treg parecem exercer um controle da resposta imune efetora ao T. cruzi no sentido de tentar controlar a disseminação do patógeno e, ao mesmo tempo, impedir a destruição tecidual decorrente de uma exacerbação da resposta imune. Portanto, sugere-se que as células Treg estariam participando da resposta imune ao T. cruzi no sentido de modular a resposta imune efetora.

Avaliação de células T regulatórias na hepatite C, na esquistossomose e na comorbidade

A hepatite C e a esquistossomose são graves problemas de saúde pública no Brasil.Quando essas doenças estão associadas na comorbidade (CM), a fibrose evoluimais rapidamente para cirrose. As células T regulatórias (T reg) são produzidas empresença de estímulo antigênico e identificadas por marcadores de superfície (CD4+,CD25+) e intracelular (FOXP3+) e pela produção de citocinas IL-10 e TGF-ß. Ainda,estão associadas à proteção do tecido hepático contra danos causados pelaresposta imune celular efetora contra o hepatitis C virus (HCV) e Schistosomamansoni. Portanto, o objetivo foi avaliar o perfil de células T reg periféricas naturais(nTreg), induzidas (iTreg) e totais em pacientes com esquistossomose (n=22), comhepatite C (n=25) e com a comorbidade (n=14). O percentual dessas células foiobtido por citometria de fluxo. Níveis de IL-10 e TGF-ß foram dosados por ELISA e aexpressão gênica de FOXP3 foi verificada por qPCR (∆Ct comparativo). Houvemaior percentual de nTreg, iTreg e de T reg total no grupo com esquistossomosecomparado ao CM (p = 0,036; 0,037 e 0,023, respectivamente). Também houvediferença entre o percentual de nTreg nos grupos esquistossomose e hepatite C (p =0,006). Ao associar estes resultados ao grau de fibrose nos grupos hepatite C e CM,não houve diferença. Os percentuais de iTreg (p = 0,026) e totais (p = 0,040) forammaiores no grupo esquistossomose em relação ao CM quando associados aopadrão D de fibrose. Nos padrões E/F houve diferença no percentual de nTreg (p =0,046) e T reg totais (p = 0,044), sendo maior também no grupo esquistossomose. AIL-10 manteve-se elevada nos grupos infectados por S. mansoni (p = 0,023). Osgrupos hepatite C (p = 0,001) e CM (p = 0,048) apresentaram níveis elevados deTGF-ß em relação ao grupo esquistossomótico. A expressão gênica de FOXP3 foimaior 4,27 e 4,89 vezes nos grupos hepatite C e esquistossomose que na CM.Conclui-se que o grupo com esquistossomose apresentou maior percentual decélulas T reg, produção elevada de IL-10 e baixos níveis de TGF-ß em relação aosgrupos hepatite C e CM. Isto sugere que o maior percentual de T reg observado emdoenças com menor morbidade está relacionado a um efeito protetor contra danoscausados ao tecido hepático.

Células T regulatórias naturais (T REGS) em doenças reumáticas: [revisão] / Natural regulatory T cells in rheumatic diseases: [review]

O sistema imune sadio deve manter o balanço entre a capacidade de responder a agentes infecciosos e de sustentar a autotolerância. A ausência de resposta adequada submete o indivíduo aos efeitos deletérios da invasão por patógenos, ao passo que o sistema respondendo de modo exacerbado pode gerar respostas inflamatórias prejudiciais. Acreditava-se que os mecanismos de deleção clonal e anergia fossem os mecanismos essenciais no controle de clones de linfócitos T auto-reativos. Apesar das evidências funcionais a favor da existência de células T supressoras, por muitos anos a imunologia falhou em identificar suas características fenotípicas e confirmar sua existência, motivo pelo qual o tema passou por longo período de descrédito. A recente demonstração de diferentes fenótipos de células, agora chamadas células T regulatórias, reintroduziu o paradigma de que a auto-reatividade é ativamente regulada também por subtipos particulares de linfócitos. Este tema é de grande interesse contemporâneo e a literatura está repleta de estudos descrevendo novos subtipos de células regulatórias, bem como a função, o fenótipo e a freqüência em condições fisiológicas e patológicas. Nesse universo, destaca-se o subtipo mais importante de células com função imunorregulatória, conhecido como células T regulatórias naturais (T REGS). Representando cerca de 5 por cento dos linfócitos T CD4 do sangue periférico, são células caracterizadas pela expressão constitutiva das moléculas FOXP3, GITR, CTLA-4 e altos níveis de CD25. As alterações deletérias nesta população resultam o desencadeamento de doenças auto-imunes em camundongos, muito semelhantes às doenças auto-imunes humanas. A presente revisão aborda os conhecimentos básicos sobre as T REGS e seu estudo em doenças reumáticas de classificação auto-imune, abrindo perspectivas para o entendimento dos mecanismos de regulação periférica e sobre a fisiopatologia dessas enfermidades. Apresenta, ainda, a perspectiva de futuras abordagens...

The healthy immune system must keep the delicate balance between the capacity to respond to exogenous antigens and to keep the tolerance to endogenous antigens. In the absence of an adequate response to exogenous agents the individual is subjected to the deleterious effect of the invasion for pathogens. On the other hand, if the immune system responds in an unwary exacerbated way harmful inflammatory consequences may result. Well-established mechanisms of maintaining self-tolerance include clonal deletion and anergy. Despite the functional evidence in favor of the existence of suppressor T cells, for many years immunologists failed to identify the phenotypic characteristics and to confirm the existence of these lymphocytes. The recent demonstration of different phenotypes of cells, now designated regulatory T cells, reintroduced the paradigm of active regulation of auto-reactivity by particular subtypes of lymphocytes. This subject is of great interest in the contemporary literature. It has been shown that excess regulatory function may be associated with increased susceptibility to infectious and neoplastic diseases. On the other hand decreased regulatory function may cause autoimmunity. In fact, several experimental models of diverse autoimmune conditions have been developed by decreasing or abolishing regulatory T cells. Counterpart of this phenomenon has been sought for in several human autoimmune diseases. At this moment it seems that the most important subtype of regulatory cells are the natural regulatory T cells (TREGS), which represent about 5 percent of peripheral blood CD4 T lymphocytes. These cells are characterized by the constitutive expression of FOXP3, GITR, CTLA-4 and high levels of CD25. The present article reviews the basic knowledge on the TREGS and the several studies describing the status and function of these cells in autoimmune rheumatic diseased.

Avaliação das células T regulatórias CD4+CD25+FoxP3+ nas formas clínicas da doença de Chagas após estímulo in vitro com antigenos recombinantes CRA e FRA de Trypanosoma cruzi / Evaluation of CD4+CD25+FoxP3+ regulatory T cells in the forms of Chagas disease after in vitro stimulation with CRA and FRA recombinant antigens of Trypanosoma cruzi

Muitos estudos têm associado à resposta imune do hospedeiro ao Trypanosoma cruzi com as diferentes manifestações clínicas da doença de Chagas crônica. Contudo, pouco se sabe sobre o papel das células T regulatórias CD4+CD25+FoxP3+ na infecção humana. Este trabalho teve como objetivo avaliar a resposta imune específica de indivíduos portadores da doença de Chagas frente à CRA (Antígeno Repetitivo Citoplasmático) e FRA (Antígeno Repetitivo Flagelar), relacionando a presença dos linfócitos T regulatórios com formas clínicas crônicas da doença. A população do estudo foi selecionada no Ambulatório de Doença de Chagas do Hospital Universitário Oswaldo Cruz/Universidade de Pernambuco, sendo constituída por portadores das formas cardíaca severa (FCS) (n=11) e indeterminada (FI)(n=20) da doença e de indivíduos não infectados (NI)(n=9). Células mononucleares de sangue periférico, obtidas do sangue coletado dos participantes, foram cultivadas na presença de CRA e FRA. A presença de linfócitos Tregs foi avaliada através da técnica de citometria de fluxo. Portadores da FI apresentaram maiores níveis de células T CD4+CD25+ que os indivíduos com a FCS. Também verificamos maior freqüência da molécula CD25 em linfócitos T CD4+ de pacientes com a FI. Não verificamos diferença na expressão de FoxP3 e na produção de IL10 por linfócitos T CD4+CD25+ entre os grupos avaliados. Entretanto, foi observada correlação positiva entre CD25 e IL10 no grupo de indivíduos portadores da FI, após estímulo com FRA. Nossos achados sugerem que linfócitos T CD4+CD25+ estão envolvidos no controle dos efeitos deletérios ocasionados pela resposta imune do hospedeiro contra o T. cruzi. Contudo, o mecanismo de ação das células T CD4+CD25+FoxP3+, específicas ao CRA e ao FRA, principalmente quanto a produção de citocinas, deve ser avaliado na doença de Chagas crônica .

Inmunidad y Helicobacter pylori / Immunity and Helicobacter pylori

Helicobacter pylori, es una bacteria Gram negativa que coloniza la mucosa gástrica y contribuye al desarrollo de patologías como la gastritis crónica, úlceras duodenales y en menor medida cáncer gástrico. Si bien la infección por H. pylori por sí sola es capaz de producir daño al epitelio gástrico a través de la expresión de numerosos factores de virulencia, es la respuesta inmune local la mayor responsable de la patogenia de las enfermedades asociadas a dicha infección. La clásica dicotomía en la respuesta T helper tipo 1 vs tipo 2 para explicar el daño asociado a la bacteria, ha dado paso a un escenario más complejo con la reciente descripción de las células T regulatorias y la existencia de nuevos perfiles de respuesta T helper como Th 17. El delicado equilibrio entre virulencia y respuesta infl amatoria inmune es principalmente regulado por la intensidad de la respuesta T regulatoria, cuya supresión permite la expresión de una respuesta efectora potencialmente responsable del daño final.

Helicobacter pylori a Gram negative bacterium that colonizes gastric mucosa and that has been associated to different disease such as chronic gastritis, duodenal ulcers and gastric cancer. Although the infection by itself is able to produce damage to the gastric mucosa through the expression and interaction of well-known virulence factors, the immune local response is strongly involved in the pathogenesis of H. pylori-associated diseases. The classic dichotomy T helper type 1 vs type 2 response to explain the damage associated to the bacterium, has been reevaluated in a more complex scenario with the recent description of the T regulatory response and the new patterns of T helper response such as Th17. The extremely well balanced equilibrium between virulence and immune inflammatory response is mainly regulated by the intensity of the T regulatory response; its suppression would allow the expression of different T helper responses that account for the final damage and clinical outcomes.