Análise in vitro da ação combinada de compostos leishmanicidas

As leishmanioses fazem parte de doenças negligenciadas, por acometer, em sua grande maioria, pessoas de países subdesenvolvidos ou em desenvolvimento, para as quais empresas farmacêuticas tem pouco interesse em financiar o desenvolvimento de novos medicamentos. O tratamento é feito utilizando antimoniais pentavalentes como primeira escolha, pentamidina (Pt), miltefosina (Mt), anfotericina B e sua formulação lipossomal. Todos causam efeitos adversos e exibem crescentes casos de resistência, logo há a necessidade de se desenvolver terapias mais seguras, eficazes e de curta duração. Neste trabalho, primeiramente, foi testada a atividade fenotípica de 18 novos compostos (ftalazinonas e imidazóis - inibidores de fosfodiesterases (PDE), imidazóis inibidores de biossíntese de ergosterol (EBI), além de quinolinas) comparando-os com dois fármacos de referência (Pt e Mt), em esquemas de monoterapia por ensaios sobre amastigotas obtidas de lesões na pata de camundongos inoculados com Leishmania amazonensis, comparando ainda com ação sobre as formas intracelulares presentes em macrófagos infectados in vitro. Dentre esses compostos, 09 não foram ativos, com EC50 > 50 \03BCM. Os mais promissores foram as ftalazinonas e imidazóis inibidores de PDEs (NPD001, NPD008, NPD040, NPD029, NPD3115, NPD3124, NPD3125, NPD3126) e o VNI (EBI), com ação leishmanicida moderada (EC50 entre 10,15 e 44 \03BCM), sendo menos efetivos que Mt e Pt (EC50 4 e 1,5 \03BCM, respectivamente). Ensaios de toxicidade dos melhores compostos sozinhos e em combinação, sobre cultivos de macrófagos revelaram que os compostos sozinhos, têm valores de LC50 > pentamidina (LC50 = 15,2 \03BCM), sendo, portanto, menos tóxicos Porém, quando comparados a miltefosina (LC50 = 157,6 \03BCM), as ftalazinonas e o imidazol NPD3126 foram mais citotóxicos. O índice de seletividade (IS) também foi calculado, e todos os compostos tiveram IS inferior aos dois fármacos. Os compostos mais potentes (NPD001, NPD008, NPD040, NPD3115 e NPD3126) foram selecionados para estudos de combinação com Mt e Pt e também entre si, sendo ainda avaliados em modelos ex vivo. Em todas as combinações, a natureza da interação foi de aditividade ou \201Csem interação\201D, segundo classificação por Odds (2003). Com relação aos ensaios de toxicidade das combinações testadas, houve perda de viabilidade celular (> 56%) somente nas maiores concentrações das proporções estudadas. Por fim, de modo a comparar e validar os dados obtidos, realizamos ensaios in vitro com amastigotas intracelulares de L. amazonensis localizadas em culturas de macrófagos. NPD008, NPD3126 e a Pt exibiram superiores potências leishmanicidas sobre os parasitos intracelulares em comparação às amastigotas livres obtidas de lesão, com os seguintes valores de EC50: pt: 0,35 \03BCM e 1,5 \03BCM; NPD008: 2,38 \03BCM e 10,8 \03BCM e NPD3126: 5,0 \03BCM e 10,15 \03BCM, respectivamente. NPD008 teve o valor de EC50 (2,38 \03BCM) inferior ao da miltefosina (5,0 \03BCM) e melhor IS (17) comparado aos demais compostos testados, e assim, seguiu para os estudos de combinação sobre amastigotas intracelulares de L. amazonensis. A semelhança do observado com amastigotas livres, NPD008 + Pt resultou em perfil de aditividade (x\03A3FICI = 1.39). Nas proporções não tóxicas de 80:20, 60:40 e 40:60 de NPD008 + pt observamos redução da carga parasitária superior a 85 %, alcançando em algumas proporções índices de supressão igual a 98 % e mesmo 100 % de redução no percentual e número de parasitos por célula hospedeira A microscopia eletrônica de varredura revelou que NPD008 + Pt induziu alterações sugestivas de inibição de divisão celular, com grande número de amastigotas duplicadas e não dissociadas, resultando em extensos grumos parasitários, como já reportado para Trypanosoma brucei incubado com inibidores de PDEs. Nosso estudo revela o efeito promissor de inibidores de PDEs sobre Leishmania amazonensis, em especial em esquemas de combinação, que merece ser explorado em futuros ensaios in vivo visando futuro desenvolvimento de novos fármacos para terapia das leishmanioses.

Avaliação fenotípica in vitro de novas amidinas aromáticas sobre Trypanosoma cruzi

A doença de Chagas (DC), causada pelo protozoário Trypanosoma cruzi, é uma doença negligenciada endêmica em diferentes regiões empobrecidas da América Latina. O tratamento, baseado em dois nitroderivados, Nifurtimox e Benzonidazol (Bz), é insatisfatório, demandando a busca de novos fármacos com ação tripanocida que sejam mais seletivos e eficazes. Nesse âmbito, o presente trabalho busca a identificação de novos agentes antiparasitários para a DC, explorando a avaliação fenotípica de novas amidinas aromáticas sintéticas in vitro incluindo ensaios de combinação entre estes compostos. Dez novas amidinas foram testadas sobre tripomastigotas sanguíneos e amastigotas de diferentes cepas do T. cruzi (Y e Tulahuen) e também sobre células de mamífero hospedeiras (linhagem L929 e células cardíacas) para determinar seu perfil eficácia e de toxicidade, respectivamente. Dentre as moléculas testadas (apresentando um ou dois grupamentos catiônicos terminais), cinco foram mais ativas sobre tripomastigotas sanguíneos que o fármaco de referência (Bz), sendo uma delas, a DB2267 (molécula dicatiônica) a mais eficaz, exibindo EC50 de 0,23 \03BCM e um índice de seletividade (IS) de 417. Esta diamidina foi 28 vezes mais ativa e cerca de três vezes mais seletiva que Bz Para determinar se a combinação de duas amidinas teria um efeito tripanocida superior ao seu uso em monoterapia, tripomastigotas sanguíneos foram incubados com DB2267 e DB2236 em proporções fixas e os resultados mostraram apenas um efeito aditivo com \01A9FIC<4. Interessantemente, quando formas intracelulares foram expostas à DB2267, sua atividade foi relacionada à cepa do parasito, sendo eficaz (EC50 = 0.87 ± 0.05 \03BCM) contra DTU II (cepa Y), mas não contra um representante da DTU VI (Tulahuen), mesmo quando utilizamos veículo diferente do DMSO (\03B2-ciclodextrina). Esta divergência pode estar relacionada a diferenças inerentes aos alvos e/ou rotas metabólicas das cepas do parasito e que merecem ser mais investigadas visando conhecer melhor a relação entre as características estruturais e ação universal das moléculas sobre DTUs e formas do T. cruzi para o desenho de compostos mais promissores. Devido à fluorescência intrínseca apresentada pelas amidinas, a captação de duas delas foi avaliada. Os dados obtidos com a amidina não ativa (DB2236) e com a outra ativa (DB2267) sobre amastigotas da cepa Y revelaram que ambas foram localizadas intracelularmente, mas em compartimentos distintos: DB2236 no citoplasma, enquanto DB2267 no núcleo. Nossos dados são encorajadores a respeito da atividade antiparasitária das amidinas aromáticas, no tocante a futuras investigações de novos agentes promissores para o tratamento da DC

Influência de citocinas e células do sistema imune na atividade do inibidor da biossíntese de ergosterol (posaconazol) na infecção experimental pelo trypanosoma cruzi / Influence of citocinas and cells of the immune system in the activity of the inibidor of the biossintese of ergosterol (posaconazol) in the experimental infection by the trypanosoma cruzi

A doença de Chagas afeta aproximadamente 18 milhões de pessoas na América Latina. O Benzonidazol (BZ) é o único fármaco utiliza do no Brasil para o tratamento e apresenta eficácia limitada na fase crônica da doença ou no tratamento de indivíduos imunossuprimidos. Na tentativa de identificar novos fármacos para o tratamento da doença de Chagas, observou- se que o Trypanosoma cruzi necessita de ergosterol para a sua sobrevivência e seu crescimento. O parasito não pode utilizar o colesterol do hospedeiro e é sensível aos inibidores da biossíntese de ergosterol (IBEs). Os bis-triazóis são uma nova geração de IBEs, que foram ativos nas fases aguda e crônica da doença de Chagas experimental. Entre eles, o Posaconazol (POS) destacou-se, apresentando eficácia no combate ao T. cruzi "in vitro" e "in vivo". O POS é uma droga candidata ao tratam ento clínico da doença de Chagas. Nesta dissertação, nós avaliamos a atividade do POS em camundongos deficientes em populações de linfócitos (TCD4 + , TCD8 + , B) e citocinas (IFN- γ e IL-12), na tentativa de identificar se há influência de alguns efetores da resposta imune na eficácia terapêutica da droga. Os camundongos deficientes (knockouts) foram infectados com a cepa Y de T. cruzi (5000 tripomastigotas/camundongo) e foram tratados por 20 dias consecutivos. Para fins comparativos, camundongos deficientes também foram tratados com BZ, assim como camundongos selvagens C57Bl/6. A parasitemia foi realizada até 60 dias após a infecção, como descrito por Brener (1962). No mesmo período, a sobrevivência dos camundongos foi monitorada. Entre 30-40 dias após o término do tratamento, camundongos com parasitemia não detectáel ao microscópio óptico foram submetidos à hemocultura, para determinar a cura. Considerando a sobrevida e a cura dos camundongos knockouts infectados pelo T. cruzi, observamos que é necessária a interação entr e o sistema imune do hospedeiro e as drogas estudadas, para que se obtenha cura parasitológica. Os linfócitos T CD4 + foram essenciais para a atividade do POS e BZ e a sua ausência torna os animais altamente suscetíveis. A citocina IFN- γ também foi essencial para o tratamento com BZ, porém, o POS foi menos influenciado por este componente. Os camundongos deficientes em linfócitos T CD8 + tiveram os melhores resultados quando tratados com BZ, ao contrário dos camundongos deficientes em linfócitos B que foram mais curados pelo POS. Nos camundongos deficientes em IL-12, o POS e o BZ tiveram a mesma atividade para reativação, mortalidade e cura. Os nossos resultados sugerem que ambas as drogas são in fluenciadas por componentes específicos do sistema imunológico. Porém, possuem mecanismo s distintos de atuação e interação com o sistema imune.