Your browser doesn't support javascript.
loading
Mostrar: 20 | 50 | 100
Resultados 1 - 6 de 6
Filtrar
1.
Nat Methods ; 13(12): 989-992, 2016 Dec.
Artigo em Inglês | MEDLINE | ID: mdl-27798609

RESUMO

We describe a red-shifted fluorescence resonance energy transfer (FRET) pair optimized for dual-color fluorescence lifetime imaging (FLIM). This pair utilizes a newly developed FRET donor, monomeric cyan-excitable red fluorescent protein (mCyRFP1), which has a large Stokes shift and a monoexponential fluorescence lifetime decay. When used together with EGFP-based biosensors, the new pair enables simultaneous imaging of the activities of two signaling molecules in single dendritic spines undergoing structural plasticity.


Assuntos
Técnicas Biossensoriais/métodos , Transferência Ressonante de Energia de Fluorescência/métodos , Corantes Fluorescentes/química , Proteínas de Fluorescência Verde/química , Proteínas Luminescentes/química , Imagem Óptica/métodos , Animais , Eletroporação , Retículo Endoplasmático/metabolismo , Feminino , Corantes Fluorescentes/metabolismo , Proteínas de Fluorescência Verde/metabolismo , Células HEK293 , Células HeLa , Humanos , Proteínas Luminescentes/metabolismo , Camundongos , Microscopia de Fluorescência por Excitação Multifotônica , Fotodegradação , Gravidez , Proteínas Recombinantes de Fusão/química , Proteínas Recombinantes de Fusão/metabolismo , Transfecção , Proteína Vermelha Fluorescente
2.
Nat Methods ; 13(12): 993-996, 2016 Dec.
Artigo em Inglês | MEDLINE | ID: mdl-27798610

RESUMO

A robust method for simultaneous visualization of all four cell cycle phases in living cells is highly desirable. We developed an intensiometric reporter of the transition from S to G2 phase and engineered a far-red fluorescent protein, mMaroon1, to visualize chromatin condensation in mitosis. We combined these new reporters with the previously described Fucci system to create Fucci4, a set of four orthogonal fluorescent indicators that together resolve all cell cycle phases.


Assuntos
Ciclo Celular/fisiologia , Proteínas Luminescentes/química , Imagem Molecular/métodos , Proteínas Recombinantes de Fusão/química , Imagem com Lapso de Tempo/métodos , Animais , Técnicas de Cultura de Células , Cromatina/metabolismo , Fase G2/fisiologia , Células HEK293 , Células HeLa , Humanos , Proteínas Luminescentes/genética , Camundongos , Mitose , Modelos Moleculares , Células NIH 3T3 , Proteínas Recombinantes de Fusão/genética , Fase S/fisiologia , Proteína Vermelha Fluorescente
3.
Sci Rep ; 6: 20889, 2016 Feb 16.
Artigo em Inglês | MEDLINE | ID: mdl-26879144

RESUMO

Many genetically encoded biosensors use Förster resonance energy transfer (FRET) to dynamically report biomolecular activities. While pairs of cyan and yellow fluorescent proteins (FPs) are most commonly used as FRET partner fluorophores, respectively, green and red FPs offer distinct advantages for FRET, such as greater spectral separation, less phototoxicity, and lower autofluorescence. We previously developed the green-red FRET pair Clover and mRuby2, which improves responsiveness in intramolecular FRET reporters with different designs. Here we report the engineering of brighter and more photostable variants, mClover3 and mRuby3. mClover3 improves photostability by 60% and mRuby3 by 200% over the previous generation of fluorophores. Notably, mRuby3 is also 35% brighter than mRuby2, making it both the brightest and most photostable monomeric red FP yet characterized. Furthermore, we developed a standardized methodology for assessing FP performance in mammalian cells as stand-alone markers and as FRET partners. We found that mClover3 or mRuby3 expression in mammalian cells provides the highest fluorescence signals of all jellyfish GFP or coral RFP derivatives, respectively. Finally, using mClover3 and mRuby3, we engineered an improved version of the CaMKIIα reporter Camuiα with a larger response amplitude.


Assuntos
Rastreamento de Células , Transferência Ressonante de Energia de Fluorescência , Proteínas de Fluorescência Verde/metabolismo , Proteínas Luminescentes/metabolismo , Sequência de Aminoácidos , Substituição de Aminoácidos , Animais , Proteína Quinase Tipo 2 Dependente de Cálcio-Calmodulina/metabolismo , Linhagem Celular , Rastreamento de Células/métodos , Transferência Ressonante de Energia de Fluorescência/métodos , Expressão Gênica , Genes Reporter , Proteínas de Fluorescência Verde/química , Proteínas de Fluorescência Verde/genética , Humanos , Proteínas Luminescentes/química , Proteínas Luminescentes/genética , Conformação Proteica , Engenharia de Proteínas , Proteínas Recombinantes de Fusão , Proteína Vermelha Fluorescente
4.
Nat Methods ; 11(5): 572-8, 2014 May.
Artigo em Inglês | MEDLINE | ID: mdl-24633408

RESUMO

A method for non-invasive visualization of genetically labeled cells in animal disease models with micrometer-level resolution would greatly facilitate development of cell-based therapies. Imaging of fluorescent proteins (FPs) using red excitation light in the 'optical window' above 600 nm is one potential method for visualizing implanted cells. However, previous efforts to engineer FPs with peak excitation beyond 600 nm have resulted in undesirable reductions in brightness. Here we report three new red-excitable monomeric FPs obtained by structure-guided mutagenesis of mNeptune. Two of these, mNeptune2 and mNeptune2.5, demonstrate improved maturation and brighter fluorescence than mNeptune, whereas the third, mCardinal, has a red-shifted excitation spectrum without reduction in brightness. We show that mCardinal can be used to non-invasively and longitudinally visualize the differentiation of myoblasts into myocytes in living mice with high anatomical detail.


Assuntos
Diferenciação Celular , Diagnóstico por Imagem/métodos , Proteínas Luminescentes/metabolismo , Microscopia de Fluorescência/métodos , Animais , Cristalografia por Raios X , Biblioteca Gênica , Células HeLa , Hemoglobinas/química , Humanos , Ligação de Hidrogênio , Masculino , Camundongos , Camundongos Nus , Dados de Sequência Molecular , Células Musculares/metabolismo , Músculo Esquelético/patologia , Músculos/patologia , Mutagênese , Mioblastos/metabolismo , Mioglobina/química , Células NIH 3T3 , Regeneração , Células-Tronco/citologia , Proteína Vermelha Fluorescente
5.
Science ; 338(6108): 810-4, 2012 Nov 09.
Artigo em Inglês | MEDLINE | ID: mdl-23139335

RESUMO

Fluorescent proteins (FPs) are widely used as optical sensors, whereas other light-absorbing domains have been used for optical control of protein localization or activity. Here, we describe light-dependent dissociation and association in a mutant of the photochromic FP Dronpa, and we used it to control protein activities with light. We created a fluorescent light-inducible protein design in which Dronpa domains are fused to both termini of an enzyme domain. In the dark, the Dronpa domains associate and cage the protein, but light induces Dronpa dissociation and activates the protein. This method enabled optical control over guanine nucleotide exchange factor and protease domains without extensive screening. Our findings extend the applications of FPs from exclusively sensing functions to also encompass optogenetic control.


Assuntos
Luz , Proteínas Luminescentes/química , Estrutura Terciária de Proteína , Proteínas Recombinantes de Fusão/química , Proteínas Adaptadoras de Transporte Vesicular/química , Proteínas Adaptadoras de Transporte Vesicular/genética , Proteínas Adaptadoras de Transporte Vesicular/metabolismo , Animais , Membrana Celular/metabolismo , Escuridão , Fluorescência , Células HeLa , Humanos , Proteínas Luminescentes/genética , Proteínas Luminescentes/metabolismo , Camundongos , Modelos Moleculares , Células NIH 3T3 , Eletroforese em Gel de Poliacrilamida Nativa , Optogenética , Conformação Proteica , Engenharia de Proteínas , Multimerização Proteica , Pseudópodes/metabolismo , Pseudópodes/ultraestrutura , Proteínas Recombinantes de Fusão/genética , Proteínas Recombinantes de Fusão/metabolismo , Serina Endopeptidases/química , Serina Endopeptidases/genética , Serina Endopeptidases/metabolismo , Proteínas não Estruturais Virais/química , Proteínas não Estruturais Virais/genética , Proteínas não Estruturais Virais/metabolismo
6.
Nat Methods ; 9(10): 1005-12, 2012 Oct.
Artigo em Inglês | MEDLINE | ID: mdl-22961245

RESUMO

A variety of genetically encoded reporters use changes in fluorescence (or Förster) resonance energy transfer (FRET) to report on biochemical processes in living cells. The standard genetically encoded FRET pair consists of CFPs and YFPs, but many CFP-YFP reporters suffer from low FRET dynamic range, phototoxicity from the CFP excitation light and complex photokinetic events such as reversible photobleaching and photoconversion. We engineered two fluorescent proteins, Clover and mRuby2, which are the brightest green and red fluorescent proteins to date and have the highest Förster radius of any ratiometric FRET pair yet described. Replacement of CFP and YFP with these two proteins in reporters of kinase activity, small GTPase activity and transmembrane voltage significantly improves photostability, FRET dynamic range and emission ratio changes. These improvements enhance detection of transient biochemical events such as neuronal action-potential firing and RhoA activation in growth cones.


Assuntos
Transferência Ressonante de Energia de Fluorescência/métodos , Proteínas de Fluorescência Verde/química , Proteínas Luminescentes/química , Sequência de Bases , Proteína Quinase Tipo 2 Dependente de Cálcio-Calmodulina/metabolismo , Proteínas Quinases Dependentes de AMP Cíclico/metabolismo , Células HEK293 , Células HeLa , Humanos , Proteínas Luminescentes/metabolismo , Dados de Sequência Molecular , Proteína rhoA de Ligação ao GTP/metabolismo , Proteína Vermelha Fluorescente
SELEÇÃO DE REFERÊNCIAS
DETALHE DA PESQUISA