Novas variantes de KPC em isolados do Complexo Klebsiella pneumoniae resistentes à ceftazidima-avibactam / New KPC variants in ceftazidime-avibactam-resistant K. pneumoniae Complex isolates

O Complexo K. pneumoniae (C-Kp) é o principal grupo de bacilos Gram-negativos responsáveis por infecções nosocomiais graves em todo o mundo e o tratamento empírico dessas infecções usualmente inclui os carbapenêmicos. O principal mecanismo de resistência a essa classe de antimicrobianos é a expressão de carbapenemases, e no Brasil, mais frequentemente as do tipo KPC. Em março de 2019 a ceftazidima-avibactam foi disponibilizada para uso clínico no Brasil, sendo amplamente utilizada no tratamento infecções causadas por bacilos gram-negativos produtores de KPC. Diversos países já relataram a presença de K. pneumoniae produtores de KPC resistentes à ceftazidima-avibactam. No entanto, há poucos relatos dessa ocorrência no Brasil. O objetivo deste trabalho foi caracterizar genotipicamente e fenotipicamente isolados do C-Kp produtores de KPC, resistentes à ceftazidima-avibactam. No período de julho/2019 a julho/2021, 46 isolados do C-Kp, um por paciente, foram detectados em diferentes sítios de infecção ou culturas de vigilância de pacientes internados em hospitais privados de seis estados brasileiros. Os isolados tiveram seu genoma completo sequenciado nas plataformas MiSeq e MinION para determinação da variante alélica de blaKPC e avaliação do seu contexto genético. As taxas de resistência ao ertapenem e à ceftazidima-avibactam foram calculadas a partir de banco de dados. A clonalidade dos isolados foi avaliada por PFGE e MLST. A localização plasmidial do gene blaKPC foi confirmada por conjugação e/ou transformação. A concentração inibitória mínima (CIM) para betalactâmicos foi determinada por microdiluição em caldo segundo o BrCAST. Ensaios imunocromatográficos, NG-Test CARBA-5 e O.K.N.V.I. RESIST-5, foram avaliados quanto à sua performance na detecção de variantes KPC. A taxa de resistência ao ertapenem entre isolados do C-Kp aumentou 15,6% em 2019 para 27,3% em 2021. A taxa de resistência à ceftazidima-avibactam entre isolados do C-Kp resistentes ao ertapenem aumentou de 4,2% em 2019 para 17,2% em 2021. Onze isolados apresentaram novas variantes de KPC designadas KPC-103 a KPC-108 e KPC-139 a KPC-143. Os demais isolados apresentavam variantes de KPC já descritas, sendo a KPC-33 a variante mais frequente (36%). Quinze grupos clonais foram identificados, sendo que a maioria dos isolados pertencia ao ST11. O grupo clonal A foi o mais numeroso e pertencia ao ST258. A principal variante detectada nesse grupo foi a KPC-33. Diferentes grupos de incompatibilidade foram identificados em plasmídeos alberguando blaKPC, sendo os grupos IncN (n=12) e IncF, com replicons FII(K)-FIB (n=11), os grupos mais frequentes, seguido de InX3-IncU (n=9) e IncQ1 (n=1). Dos 46 isolados resistentes à ceftazidima-avibactam, 36 foram capazes de transferir o gene blaKPC para cepas receptoras. A maioria dos isolados foi sensível dose padrão ou sensível aumentabdo exposição ao meropenem e apresentaram redução significativa da CIM quando o avibactam foi adicionado ao aztreonam. O NG-Test CARBA-5 detectou 12 das 24 variantes testadas enquanto que o O.K.N.V.I. RESIST-5 detectou apenas nove variantes. A grande diversidade de variantes KPC, e a predominância do grupo clonal ST11, e da KPC- 33 retratam um cenário preocupante no Brasil

The K. pneumoniae Complex (C-Kp) is the main group of gram-negative bacilli responsible for serious nosocomial infections worldwide and the empirical treatment of these infections usually includes carbapenems. The main mechanism of resistance to this class of antimicrobials is the expression of carbapenemases, and in Brazil, more frequently the KPC type. In March 2019, ceftazidime-avibactam was available for clinical use in Brazil, being widely used to treat infections caused by KPC-producing gram-negative bacilli. Several countries have already reported the presence of KPC-producing K. pneumoniae resistant to ceftazidime-avibactam; however, there are few reports of this occurrence in Brazil. This work aimed to genotypically and phenotypically characterize KPC-producing C-Kp isolates resistant to ceftazidimeavibactam. From July 2019 to July 2021, 46 C-Kp isolates, one per patient, were detected in different sites of infection or surveillance cultures from patients admitted to private hospitals in six Brazilian states. The isolates had their complete genome sequenced on the MiSeq and MinION platforms to determine the allelic variant of blaKPC and evaluate its genetic context. Resistance rates to ertapenem and ceftazidime-avibactam were calculated from a database. The clonality of the isolates was evaluated by PFGE and MLST. The plasmid location of the blaKPC gene was confirmed by conjugation and/or transformation. The minimal inhibitory concentrations for beta-lactams were determined by broth microdilution according to BrCAST. Immunochromatographic assays, NG-Test CARBA-5 and O.K.N.V.I. RESIST-5, were evaluated for its performance in detecting KPC variants. The resistance rate to ertapenem among C-Kp isolates increased from 15.6% in 2019 to 27.3% in 2021. The resistance rate to ceftazidime-avibactam among ertapenem-resistant C-Kp isolates increased from 4.2% in 2019 to 17.2% in 2021. Eleven isolates showed new KPC variants designated KPC-103 to KPC-108 and KPC-139 to KPC-143. The remaining isolates presented previously described KPC variants, with KPC-33 being the most common variant (36%). Fifteen clonal groups were identified, with most isolates belonging to ST11. Different incompatibility groups were identified in plasmids harboring blaKPC, with the IncN (n=12) and IncF groups, with FII(K)-FIB(n=11) replicons, being the most frequent groups, followed by InX3-IncU (n= 9) and IncQ1 (n=1). All IncX3-IncU plasmids were approximately 46 kb in size and were identified among isolates belonging to the largest identified clonal group (A) and ST258. The main variant detected in this group was KPC-33. Of the 46 ceftazidime-avibactam-resistant isolates, 36 were able to transfer the blaKPC gene to recipient strains. Most isolates were susceptible standard dose or susceptible increased exposure to meropenem and showed a significant decrease in MIC when avibactam was added to aztreonam. The NG-Test CARBA-5 was able to detect 12 of the 24 variants evaluated while the O.K.N.V.I. RESIST-5 detected only nine variants. The great diversity of KPC variants, the predominance of the ST11 clonal group, and KPC-33 portray a worrying scenario in Brazil

Carbapenemases novas ou emergentes em Pseudomonas aeruginosa / New or emerging carbapenemases in Pseudomonas aeruginosa

Pseudomonas aeruginosa é um importante agente de infecções relacionadas à assistência à saúde em todo o mundo. O tratamento empírico de infecções graves causadas por esta espécie usualmente inclui os carbapenêmicos. Essa terapia, se inadequada, está relacionada a um aumento significativo da mortalidade. Os principais mecanismos de resistência aos carbapenêmicos em bacilos Gram-negativos são a redução da permeabilidade da membrana externa, hiperexpressão de bombas de efluxo e produção de betalactamases, sendo este último, o mais eficiente. O objetivo deste trabalho consistiu na caracterização de carbapenemases novas ou emergentes e seu contexto genético em P. aeruginosa. Foram utilizados 11 isolados de P. aeruginosa capazes de hidrolisar o imipenem em ensaio espectrofotométrico e negativos para genes de carbapenemases conhecidos e uma cepa produtora de KPC-2. Tais isolados foram submetidos à confirmação do perfil de resistência aos carbapenêmicos pelos métodos de disco-difusão e microdiluição em caldo (CIM), bloqueio enzimático com EDTA e Blue-Carba. O perfil plasmidial foi avaliado utilizando-se os métodos de lise alcalina e eletroforese em campos pulsados (PFGE). Os genomas foram sequenciados utilizando-se o sistema MiSeq. O perfil clonal dos isolados foi avaliado por PFGE e Multilocus Sequence Typing (MLST). Dez isolados apresentaram Blue-Carba negativo, compatível com a presença de carbapenemases fracas. Quatro isolados apresentaram plasmídeos, visualizados em gel de agarose após PFGE. Os plasmídeos do isolado D5303023 foram eletroporados em E. coli TOP 10 e selecionados em meio LB contendo 1µg/mL imipenem, contudo não foram obtidos transformantes. A análise por PFGE identificou sete grupos clonais distintos. Quanto à tipagem por MLST, foi detectado um novo tipo ST3187 e os ST277 e ST1560 foram os predominantes. O isolado D9203039 apresentou uma carbapenemase GES-20 associada a uma betalactamase de espectro estendido GES-19, sendo os genes que as codificam localizados no integron In724. Esse isolado pertence ao ST309, clone de potencial alto risco, associado ao fenótipo de resistência a múltiplos antimicrobianos no México. O genoma da cepa positiva para KPC-2 foi digerido com a S1 nuclease e submetido à PFGE, evidenciando um plasmídeo de aproximadamente 453 kb. Após análise do sequenciamento confirmou-se que a cepa pertence ao ST446 e foi observada a presença do gene blaKPC-2 em um contig de 128.487 bp. Este contig apresentou 99,9% de similaridade com o plasmídeo 1 da cepa P. aeruginosa RW109; no entanto, ensaios de conjugação bacteriana falharam em obter colônias de transconjugantes. O gene blaKPC-2 foi encontrado flanqueado à montante por uma estrutura truncada de um transpóson da família Tn3 e à jusante por uma ISKpn6 truncada. As análises das sequências de DNA das demais cepas evidenciaram a presença de sequências gênicas, que traduzidas, apresentavam similaridade para sete metalobetalactamases (MBL), indicando a potencial presença de novos genes de carbapenemases. Foi caracterizada pela primeira vez no Brasil cepa produtora da carbapenemase GES-20 e o novo ST3187. Foram detectados potenciais novos genes de carbapenemases. O gene blaKPC-2 no isolado J5083553 tem provável localização plasmidial

Pseudomonas aeruginosa is a major agent of healthcare-related infections worldwide. Empirical treatment of serious infections caused by this species usually includes carbapenems. This therapy, if inadequate, is related to a significant increase in mortality. The main mechanisms of carbapenem resistance in Gram-negative bacteria are the reduction of outer membrane permeability, overexpression of efflux pumps and beta-lactamase production, the latter being the most efficient. The aim of this work was the characterization of new or emerging carbapenemases and their genetic context in P. aeruginosa. Eleven P. aeruginosa isolates capable of hydrolyzing imipenem in spectrophotometric assay and negative for known carbapenemases genes were used, as well as a KPC-2 producing strain. These isolates were subjected to confirmation of carbapenem resistance profile by disk diffusion, broth microdilution (MIC) and enzyme inhibition by EDTA and Blue-Carba methods. Plasmid profile was evaluated using alkaline lysis and pulsed field electrophoresis (PFGE) methods. Genomes were sequenced using the MiSeq system. The clonal profile of the isolates was evaluated by PFGE and Multilocus Sequence Typing (MLST). Ten isolates presented negative Blue-Carba, compatible with the presence of weak carbapenemases. Four isolates presented plasmids visualized on agarose gel after PFGE. The plasmids of isolate D5303023 were electroporated into E. coli TOP 10 and selected in LB medium containing 1 µg/mL imipenem, however no transformants were obtained. The PFGE analysis identified 7 distinct clonal groups. As for MLST typing, a new type ST3187 was detected and the ST277 and ST1560 were the predominant types. The genome of the KPC-2 positive strain was digested with S1 nuclease and subjected to PFGE, evidencing a plasmid of approximately 453 kb. Isolate D9203039 presented a GES-20 carbapenemase associated with a GES-19 extended spectrum beta-lactamase. The genes encoding them were located in the In724 integron. This isolate belonged to ST309, a potential high risk clone, associated with the multidrug resistant strain in Mexico. After sequencing it was confirmed that the strain belongs to ST446 and it was observed the presence of the blaKPC-2 gene in a contig of 128,487 bp. This contig was 99.9% similar to plasmid 1 of the P. aeruginosa RW103 strain. However, bacterial conjugation assays failed to obtain transconjugant colonies. The blaKPC-2 gene was found flanked upstream by a truncated structure of a Tn3 family transposon and downstream by a truncated ISKpn6. DNA sequence analysis of the other strains showed the presence of gene sequences, which translated, showed similarity to seven metallo-beta-lactamases (MBL), indicating the potential presence of new carbapenemase genes. It was characterized for the first time in Brazil carbapenemase producing strain GES-20 and the new ST3187. Potential new carbapenemase genes were detected. The blaKPC-2 gene in isolate J5083553 has plasmid localization