Entamoeba histolytica: correlation of assessment methods to measure erythrocyte digestion, and effect of cysteine proteinases inhibitors in HM-1:IMSS and HK-9:NIH strains.

Entamoeba histolytica trophozoites are able to degrade human erythrocytes; the loss of erythrocyte cellular matrix and degradation of plasma membrane were observed, along with the decrease in the average size of digestive vacuoles. Ninety-six percent of hemoglobin ingested was hydrolyzed by trophozoites within 3h, as evidenced by electrophoresis. Accordingly, X-ray spectroscopy revealed the presence of iron inside vacuoles after erythrophagocytosis, the concentration of which decreased to control levels in a similar period. Quantification of erythrocyte digestion at the early and late periods was determined by a spectrophotometric procedure, with t(1/2)=1.67 h and 35-min for HM-1:IMSS and HK-9:NIH trophozoites, respectively. In the latter, activity was due to the combined action of intracellular enzymatic activity and exocytosis. E-64c and leupeptin totally inhibited erythrocyte digestion within a 3-h period, thereafter hydrolysis took place at lower rate. Our results suggest that erythrocyte digestion in E. histolytica proceeds in different ways in these two amebic strains, and can be blocked by proteinase inhibitors.

Quitosana, prótesis nerviosa biodegradable y vehículo de liberación de esteroides en la regeneración del nervio facial de conejos: análisis ultra estructural / Chitosan, a biodegradable nerve prosthesis and steroid liberation method in the repair of facial nerve in rabbits: an ultra structural analysis

En la actualidad, la utilización de nuevos métodos quirúrgicos para evitar el injerto nervioso, mediante el uso de compuestos bioactivos, se ha constituido en un campo emergente de biotecnología orientada a la reparación de lesiones nerviosas utilizando compuestos neurotróficos o células liberados desde el biomaterial en contacto con el tejido dañado. Hasta el presente no existen reportes del biomaterial quitosana en la tubulización de nervios craneales y como vehículo de liberación in situ de neuroesteroides. Mediante cromatografía de gases se analizó la liberación de neuroesteroides desde prótesis de quitosana implantadas vía subcutánea y el crecimiento nervioso fue analizado mediante microscopía electrónica de transmisión y análisis morfométrico a los 15 y 45 días después de la axotomía. Los neuroesteroides presentes en las prótesis de quitosana fueron liberados en un periodo mayor de 60 días. A los 15 días de la axotomía los segmentos proximal y distal de los crecimientos nerviosos tratados con neuroesteroides revelaron fibras nerviosas no mielinizados y células de Schwann los cuales mostraron diferencias significativas con respecto de los nervios vehículo. A los 45 días, se distinguieron fibras nerviosas mielinizadas de diferentes calibres y grados de mielinización. Los principales efectos favorables sobre regeneración nerviosa se observaron por la influencia de progesterona, evidenciadas por un incremento en el numero de fibras mielinizadas, diámetro, proporción g en comparación con el nervio control vehículo. Los resultados ponen de manifiesto la utilidad del biomaterial quitosana como prótesis y vehículo de liberación de neuroesteroides para promover la regeneración nerviosa.

La progesterona promueve la regeneración del nervio facial a través de cámaras de silicon en hamsters / Progesterone enhaces facial nerve regeneration through silicone chambers in hamsters

Estudios in vivo en el nervio ciático de ratones demostraron que los neuroesteroides progesterona y su precursor pregnenolona promueven la mielinización en el sistema nervioso periférico. Se utilizó la rama bucal del nervio facial de 99 hámster machos y se analizó la regeneración nerviosa en defectos nerviosos de 6 y 8 mm de longitud a los 15, 30, 60 y 90 días postlesión. Los segmentos nerviosos se introdujeron en tubos de Silastic, y se colocó en su interior progesterona o solución salina. La regeneración nerviosa fue evaluada mediante estudios de microscopía de luz, microscopía electrónica de transmisión, técnicas morfométricas y electromiografía. El análisis morfométrico reveló diferencias significativas entre los nervios regenerados tratados con neuroesteroides en comparación con los nervios de los grupos tratados con solución salina y el nervio normal: el número de fibras mielinizadas y el promedio del área de mielina fue mayor que los grupos tratados con salino. La mayor proporción de éxito (0.77-0.88) se logró en defectos de 6 mm y fue menor en defectos de 8 mm (0.12-0.25). Los resultados sugieren (a) se apoya la regeneración nerviosa mediante este método por la formación de un cable nervioso, lo que elimina potencialmente la necesidad de un injerto en la reparación de defectos nerviosos, y, (b) el uso de progesterona sistémica o en el interior de los tubos pueden tener influencia benéfica sobre la regeneración nerviosa.

Congo red effect on cyst viability and cell wall structure of encysting entamoeba invadens

Background. The cell wall of Entamoeba invadens cysts is composed of chitin microfibrils as the main structural component. It has been demonstrated in yeast that the chitin cell wall assembly is altered by dyes such as Congo red (CR) and Calcofluor. Methods. The purpose of this work was to study the cell wall assambly under the effect of CR dye on encysting E. invadens by means of light and electron microscopy, after the ammebas were subjected to the effect of 100-2,000 µg CR/mL. Experiments were performed either in BI-S-33 or in mLG media. Results. Trophozoit growth was not inhibited by 100-1,000 µg/mL CR after 8 days of incubation in BI-S-33 medium. However, low levels of growth were observed with 2,000 µg/mL of dye. No significant differences in morphologically viable (hyaline) cyst production occurred after 24-48 hm when 100 µg CR/mL was used, while the highest concentration of CR (2,000 µg/mL) resulted in a significant decrease of hyaline cyst yield; dead cysts prevailed in cultures, particularly at 72 h of CR treatment. Differentiation of amebas incubated in the presence of 500-2,000 µg/mL CR produced abnormal chitin deposits, rendering irregulary thick or double cell walls, as shown by transmission and scanning electron microscopy. Cyst cultures obtained under 100 µg/mL CR produced as many trophozoites as did the control when they were incubated in BI-S-33, but only low numbers of trophozoites were found in culture cysts obtained under higher CR doses. Conclusion. Our results suggest that CR affects E. invadens encystment, alters the cell wall formation, and also affects the cyst viability

Intracellular digestion of human erythrocytes by Entamoeba histolytica: a kinetic study in vitro

The objective of this investigation was to quantitatively evaluate, by using light and transmission electron microscopy, the intracellular digesion of human erythrocytes (HE), ingested by Entamoeba histolytica trophozoites in vitro. Amebas fed 10 min with HE were postincubated 3 - 12 h at 36.5ºC without HE, and fixed with glutaraldehyde. After staining by the benzidine reaction, HE per ameba, and percent of amebas containing at least one HE were determined by light microscopy. Trophozoites ingested an average of eight HE per ameba and 92 percent of them contained HE after the 10 min pulse. Erithrocytes were clearly observed as reddish-brown corpuscles in the amebic cytoplasm. During postphagocytosis incubations progressive loss of HE staining, as well as changes in size of food vacuoles, were observed, thus proving the intracellullar digestion of HE. The hydrolysis of HE was corroborated with the electro microscope, the HE cytoplasmic matrix being the first structure catabolized and later the plasma membrane. Quantitative analysis demostrated decrease of 56 percent of ameba containing HE, and 1.35 HE per ameba on average, after 3 h postphagocytosis. Afterwards, both parameters decreased at a slow rate until HEdisappeared. The t ½ of HE witin amebas was 2 h

Producción masiva de quistes de Entamoeba histolytica en condiciones axénicas / Massive production of Entamoeba hystolityca's cysts in axénic conditions

Después de la fase exponencial de crecimiento, las amibas de la cepa HK9, mantenidas axénicamente en el medio PEHPS, adquieren en forma espontánea varias semejanzas morfológicas con los quistes naturales y resistencia a choques hipotónicos por ele efecto de una pared, la cual está compuesta parcialmente por polisacáridos. El número de amibas diferenciadas aumenta paulatinamente, pero su viabilidad disminuye, en función del tiempo de incubación, hasta que al noveno día 96 por ciento de la población está constituido por este tipo de células, si bien sólo 6 por ciento de ellas es viable. La estructura ultramicroscópica de la gran mayoría de amibas diferenciadas corresponde a la de quistes inmaduros. Estos y el medio PEHPS constituyen un buen modelo para la caracterización de la iniciación de la diferenciación de E.histolytica y abren la posibilidad de obtener, en condiciones axénicas, cultivos masivos de quistes maduros del agente causal de la amibiasis

Localización intracelular de vacuolas con actividad de fosfatasa ácida en trofozoitos de entamoeba hystolitica adheridos a epitelio cecal de cobayo / Intercellular distribution of acid phosphatas evacuadas in entamoeba histolytica trophosortes adhered to guinea pig cecal ephithelium

Con el objetivo de dilucidar la distribución y el posible papel que desempeñan las vacuolas positivas a la fosfatasa ácida (VFAs) de los trofozoítos de Entamoeba histolytica, durante la fase inicial de interacción de la amibas con el epitelio intestinal; se utilizó como modelo experimental el epitelio cecal del cobayo, que se incubó in vitro con trofozítos de E. histolytica de la cepa HM1;IMSS. Despues de 30 minutos de interación entre las amibas y el epitelio, los trofozítos se observaron en las siguientes situaciones: a) adheridos a epitelio morfológicamente intacto; b) adheridos a cúmulos de células epiteliais descamadas; c) en proceso de fagocitosis de células epiteliales en descamación y restos celulares; d) en proceso de invasión a través de las zonas de descamación. Los trofozoítos en fase a y b mostraron en el citoplasma numerosas VFAs, distribuídas en forma irregular. Las amibas en fase c tuvieron las VFAs localizadas en la zona citoplámica opuesta al estoma de fagocitosis. La VFAs, así como fagosomas que tuvieron producto de reaccicón de fosfatasa ácida, se observaron distribuidos irregularmente en los trofozoítos en fase d. La integridad del revestimiento epitelial con amibas adehridas, el hecho de que la invasión y destrucción del epitelio se observó exclusivamente a través de las zonas de descamación y la ausencia de VFAs en el citoplasma amibiano en fase de expulsión de posibles productos tóxicos para las células epiteliales, son evidenciais de que las VFAs no participan en el daño inicial del epitelio, sino que sólo parecen estar involucradas en la digestión del material fagocitado

Ultraestructura de quistes de Entamoeba invadens obtenidos bajo el efecto de emetina, tinidazol y rifampicina / Ultraestructure of entamoeba invadens cysts obtained under the effect of emetine, tinidazole and rifampin

Se determinaron las concentraciones inhibitorias mínimas (CIM) de emetina, tinidazol y rifampicina para trofozoítos de E. invadens, así como la ultraestructura de quistes obtenidos después de 22 y 45 horas, en presencia de la CIM de los fármacos. Bajo el efecto de tinidazol o de rifampicina los quistes obtenidos mostraron numerosas vacuolas que contenían elementos membranosos y vesículas llenas de material amorfo electrodenso; algunas de éstas se observaron en las proximidades de la membrana plasmática. En los quistes obtenidos en presencia de emetina, el citoplasma presentó numerosas vesículas y cisternas aplanadas particularmente después de 22 horas de incubación en médio de enquistamiento, las que disminuyeron después de 45 horas de diferenciación; se observaron además vasículas con material electrodenso próximas a la membrana plasmática. Las paredes celulares de los quistes obtenido bajo el efecto de los fármacos mencionados fueron irregulares tanto en el arreglo fibrilar como en el espesor; adicionalmente, bajo los efectos de tinidazol y emetina las paredes de los quistes se perdieron parcial o totalmente, observándose acúmlos de éstas entre los quistes. Los resultados sugieren que la CIM de los fármacos empleados provocaron un retardo en el proceso de difereciación de E. invadens y, posiblemente, interfieran con el ensamble de la pared celular y con la adherencia de ésta a la membrana plasmática durante el enquistamiento