In vitro photoautotrophic cultivation of Melocactus zehntneri: insights from allometric characteristics from germination to acclimatization

Melocactus zehntneri is a species of ornamental relevance suffering anthropogenic pressures, putting its preservation at risk. Thus, alternatives for propagating and conserving this species are needed. This study evaluated the effect of photoautotrophic cultivation of M. zehntneri to produce plants well acclimated to natural conditions. The seeds underwent different imbibition times before in vitro germination. Besides the growth room, a greenhouse hosted the photoautotrophic cultivation of seedlings. Vermiculite replaced agar in the culture medium. The imbibition pre-treatment in distilled water and the growth environments affected some parameters linked to germination. The greenhouse provided better characteristics for plants grown in vitro and for acclimatization than those kept in the growth room. Plants cultivated and acclimated ex vitro in a greenhouse photoautotrophic environment showed improved characteristics regarding ornamental significance.

The cryoprotectant PVS2 plays a crucial role in germinating Passiflora ligularis embryos after cryopreservation by influencing the mobilization of lipids and the antioxidant metabolism.

Cryopreservation is a process whereby biological structures are preserved in liquid nitrogen (-196 °C) without losing their viability. Many cryopreservation techniques use the Plant Vitrification Solution 2 (PVS2) for cryoprotection. This study will therefore evaluate the influence of different exposure times to the cryoprotectant PVS2 and discuss the importance of the mobilization of reserves and the antioxidant metabolism during the germination of cryopreserved Passiflora ligularis embryos. The composition of P. ligularis seeds was analytically determined. We tested the germination capacity and the Germination Speed Index (GSI) of embryos (that is, seeds without external tegument) which were exposed to different PVS2 exposure times (0, 30, 60 and 120 min) at 30 days after thawing. Proline content, hydrogen peroxide, activity of isocitrate lyase (ICL), malate synthase (MSy), lipid peroxidation and antioxidant enzyme activities (SOD, CAT, APX) were measured at 7, 14 and 21 days after cryopreservation. The germination from cryopreserved embryos was maximal (85%) after 60 min PVS2 exposure with a GSI of 0.6. At 60 min, the highest activity of the enzymes involved in the glyoxylate cycle, ICL and MSy were recorded. We hypothesize that a 60 min exposure to PVS2 accelerates the reserve mobilization which correlates positively with germination. Until 60 min, there was a positive correlation between the PVS2 exposure time and the proline content, as well as the activity of antioxidant enzymes (SOD, CAT, APX), and a negative correlation with the lipid peroxidation. This study enables us to optimize the long-term conservation of this species. In conclusion, fundamental research is necessary to optimize the cryopreservation procedure, and this study offers an effective and efficient workflow which can be extrapolated to other (oil-rich) species.

Behavior of lateral buds of Hancornia speciosa after cryopreservation by encapsulation-vitrification / Comportamento de gemas laterais de Hancornia speciosa após criopreservação por encapsulamento-vitrificação

Hancornia speciosa is a fruitful species from Cerrado biome with high economic potential. However, the intense and disordered extractivism have caused a reduction of its population in its endemic area. In addition, seed recalcitrance negatively affects the conventional conservation of the species. Aiming to find alternatives that enable the long-term conservation of this species, the study's objective was to assess the behavior of lateral bud's regrowth after cryopreservation procedures by encapsulation-vitrification technique. Sodium alginate capsules containing lateral buds were pre-cultured in liquid WPM supplemented with 1.0 M glycerol, and subsequently exposed to different concentrations of sucrose (0.3; 0.75 and 1.0 M) for 24 or 48 hours. The capsules were subjected to dehydration in silica gel or airflow hood for 0, 1, 2 and 3 hours before different incubation times in PVS2 (0, 15, 30, 60 and 120 minutes) at 0°C. A high regeneration percentage of lateral buds was observed after cryopreservation of capsules treated with 0.75 M sucrose plus 1.0 M glycerol (24 hours), associated with dehydration in an airflow hood (1 hour) and immersion in PVS2 (15 minutes). Encapsulation-vitrification allowed the long-term conservation, and provided high plant material survival rates after cryopreservation of Hancornia speciosa sensitive explants.

Hancornia speciosa é uma frutífera do Cerrado com elevado potencial econômico. Entretanto, o extrativismo desordenado causou a redução populacional em sua área endêmica. Além disso, a recalcitrância da semente afeta negativamente sua conservação convencional. Buscando alternativas de conservação para essa espécie, objetivou-se avaliar a regeneração das gemas laterais após a técnica de encapsulamento-vitrificação. Cápsulas de alginato de sódio contendo gemas laterais foram pré-cultivadas em meio WPM acrescido de 1,0 M de glicerol e, posteriormente, imersas em diferentes concentrações de sacarose (0,3; 0,75 e 1,0 M) por 24 ou 48 horas. As cápsulas foram submetidas à desidratação em sílica gel ou em fluxo laminar por 0, 1, 2 e 3 horas antes de sua incubação em diferentes tempos de PVS2 (0, 15, 30, 60 e 120 minutos). Elevada porcentagem de regeneração de gemas laterais foi observada após a criopreservação de cápsulas tratadas com 0,75 M de sacarose + 1,0 M de glicerol por 24 horas, associado com a desidratação em fluxo laminar (1 hora) e imersão em PVS2 (15 minutos). O encapsulamento-vitrificação é eficiente para a conservação de longo prazo e permite a obtençao de altas taxas de sobrevivência após a criopreservação de explantes sensíveis (gemas laterais) de Hancornia speciosa.

Indirect in vitro organogenesis of Hancornia speciosa Gomes / Organogênese indireta in vitro de Hancornia speciosa Gomes

Hancornia speciosa Gomes is a fruit species belonging to the Apocynaceae family and holds social, cultural and economic potential mostly due to its use in composition of many food industry products and the consumption its fruits in natura. Several aspects regarding their propagation need further studies, since the species is undergoing a continuous process of domestication. The objective was to obtain an in vitro protocol for indirect organogenesis and rooting with subsequent acclimatization of H. speciosa plants. To obtain indirect organogenesis, internodal segments were inoculated in WPM culture medium gelled with 7 g L-1 agar, added with 30 g L-1 sucrose, 0.4 g L -1 PVP, and supplied with different concentrations of 2,4-D (0.0; 2.46; 7.38; 12.30; and 17.22 µM), BAP (0.0; 4.92; 9.84; 14.76; and 19.68 µM), and TDZ (0.0; 4.92; 9.84; 14.76; and 19.68 µM). For the in vitro rooting, shootings with approximately 6.0 cm diameter length kept for 15 days in WPM medium with no plant growth regulator and, afterwards, subjected to treatments with different auxins (Control; 9.84 µM IBA; 9.84 µM NAA; and 9.84 µM IAA) as well as the combination among them, in order to verify their effects on percentage of rooting (%), number of roots, and average length of the largest root (cm). The formation of calluses was observed in all explants subjected to the concentrations of the regulators tested. The highest shooting regeneration occurred with 7.38 µM 2,4-D (73%). The highest percentage of shoot rooting (80%) and roots with the largest length (1.3 cm) were found in the culture medium with the combination of 4.92 µM NAA and 4.92 µM IBA. The in vitro regeneration of H. speciosa is feasible. The acclimatization of rooted shoots in Trospstrato® was accomplished with successful and 100% survival of plant material was observed during this stage.

Hancornia speciosa Gomes é uma frutífera pertencente à família Apocynaceae e possui grande potencial social, cultural e econômico, principalmente devido à utilização de seus frutos na composição de diversos produtos do setor alimentício e para consumo in natura. Vários aspectos de sua propagação necessitam de maiores estudos, uma vez que a espécie passa por um contínuo processo de domesticação. Objetivou-se obter um protocolo de organogênese indireta e de enraizamento in vitro, com posterior aclimatização das plantas de H. speciosa. Para a obtenção de organogênese indireta, segmentos internodais foram inoculados em meio de cultivo WPM gelificado com ágar 7 g L-1, acrescido de 30 g L-1 de sacarose, 0,4 g L-1 de PVP e suplementado com diferentes concentrações de 2,4-D (0,0; 2,46; 7,38; 12,30 e 17,22 µM), BAP (0,0; 4,92; 9,84; 14,76 e 19,68 µM) e TDZ (0,0; 4,92; 9,84; 14,76 e 19,68 µM). Para o enraizamento in vitro, foram utilizadas brotações com aproximadamente 6,0 cm de comprimento, mantidas por 15 dias em meio WPM isento de fitorreguladores e, em seguida, submetidas a tratamentos com diferentes auxinas (Controle; 9,84 µM de AIB; 9,84 µM de ANA e 9,84 µM de AIA), bem como as combinações entre estes reguladores (4,92 µM AIA + 4,92 µM AIB; 4,92 µM ANA + 4,92 µM AIB; 4,92 µM ANA + 4,92 µM AIA). Foi observada formação de calos em todos os explantes submetidos às concentrações dos reguladores testados. A maior regeneração de brotação ocorreu com 7,38 µM de 2,4-D (73%). Maior porcentagem de enraizamento das brotações (80%) e raízes com maior comprimento (1,3 cm) foi verificada em meio de cultivo contendo a combinação de 4,92 µM de ANA e 4,92 µM de AIB. É possível a regeneração in vitro de H. speciosa. A aclimatização foi realizada com sucesso, com 100% de sobrevivência das plantas.

Vitamin C and total phenols quantification in calli of native passion fruit induced by combinations of Picloram and Kinetin / Quantificação de vitamina C e fenóis totais em calos de maracujazeiro nativo induzidos por combinações de Picloram e Cinetina

Brazil is one of the center of origin of passion fruit and has an important natural variability of the genus Passiflora. Several wild species of this genus are resistant to some pests and diseases and many are considered as medicinal. The aim of this research was to induce callus from in vitro Passiflora gibertii leaf explants for quantification of vitamin C and total phenols. Once the appropriate auxin/cytokine balance promotes callus formation and may optimize the production of secondary compounds and vitamins, calli were induced using a half-strength MS medium with a combination of the auxin Picloran (PIC) and the cytokine Kinetin (KIN). The vitamin C and total phenols were quantified by colorimetric methods from calli after different culture periods. The calli induction was strongly dependent of the combination PIC/KIN. It was observed high vitamin C content (94.8mg 100g-1) during the calli induction period in MS+4.14µM PIC+ 0.207µM KIN. Higher PIC/KIN concentrations promoted an increase in the vitamin C content after three subcultures. The higher PIC (8.28µM)/KIN (0.828µM) concentration was the higher was the total phenols production (66mg tannic acid 100g-1 of fresh callus) during the calli induction period.

O Brasil é um dos centros de origem do maracujazeiro e possui uma importante variabilidade natural do gênero Passiflora. Muitas espécies selvagens desse gênero são resistentes a algumas pragas e doenças e várias são consideradas medicinais. O objetivo deste trabalho foi induzir calos in vitro a partir de folhas de Passiflora gibertii para a quantificação de vitamina C e fenóis totais. Uma vez que o balanço adequado entre auxina/citocinina promove a formação de calos e pode otimizar a produção de compostos secundários e vitaminas, calos foram induzidos em meio MS meia-força com uma combinação da auxina Picloram e da citocinina Cinetina, todos na ausência de luz. O teor de vitamina C e de fenóis totais foi quantificado por métodos colorimétricos após diferentes períodos de cultivo dos calos. A indução de calos foi fortemente influenciada pela combinação de Picloram/Cinetina. Foi observado um alto teor de vitamina C (94,8mg 100g-1) durante o período de indução de calos em MS+4,14µM de Picloram+0,207µM de Cinetina. Altas concentrações de Picloram/Cinetina conduzem a um aumento no teor de vitamina C após três subcultivos. Quanto maior a concentração de Picloram (8,28µM)/Cinetina (0,828µM), maior é a produção de fenóis (66mg de ácido tânico 100g-1 de calos) totais durante o período de indução de calos.

Decontaminant solution on in vitro growth of Byrsonima intermedia seedlings / Solução desinfestante no crescimento in vitro de plântulas de Byrsonima intermedia

Byrsonima intermedia A. Juss. é uma planta medicinal e frutífera do Cerrado, cuja propagação convencional é difícil, devido à presença do endocarpo extremamente lignificado. Embora o hipoclorito de sódio (NaOCl) seja amplamente utilizado para a desinfestação superficial, existem poucos relatos de seus efeitos sobre o crescimento do explante. Neste trabalho, o objetivo foi estudar o efeito de diferentes pHs e períodos de exposição de sementes de B. intermedia em uma solução de NaOCl. As sementes foram submetidas a diferentes tempos de exposição (1, 5 e 10 minutos) numa solução de NaOCl com diferentes pHs (5, 7, 10 e 12) e, após o tratamento com hipoclorito de sódio, os embriões foram inoculados em meio WPM com a concentração de 50% de sais sem sacarose, ágar a 0,5% e pH 5,8 e, depois de 75 dias de cultivo, o crescimento das plântulas foi avaliado. A utilização de NaOCl é eficaz na desinfestação de sementes de B. intermedia, independente da variação do pH ou dos períodos de exposição. A porcentagem de plântulas normais, o comprimento da parte aérea e o número de folhas são positivamente afetados pela utilização de solução de NaOCl a pH de 8,5-8,9 ou pelo aumento do período de exposição, enquanto o número de raízes é afetado apenas pelo aumento do período de exposição na solução NaOCl.

Byrsonima intermedia A. Juss., is a medicinal and fruit plant of the Cerrado in which the conventional propagation is difficult due to the presence of extremely lignified endocarps. Although sodium hypochlorite (NaOCl) is widely used in the surface decontamination, there are few reports of its effects on explant growth. The aim of this work was to study the effect of different pH and exposure periods of B. intermedia seeds to a NaOCl solution. Seeds were subjected to different exposure periods (1, 5 and 10 minutes) to a NaOCl solution at different pH (5, 7, 10 and 12) and after treatment with NaOCl, embryos were inoculated in a WPM medium with 50% concentration of salts without sucrose, 0.5% agar and pH 5.8 and after 75 days of culture the growth of seedlings was evaluated. The use of NaOCl is effective in the decontamination of B. intermedia seeds, independent of pH variation and exposure periods and the parameters such as percentage of normal seedlings, shoot length, and number of leaves are positively affected by the use of NaOCl solution at pH 8.5-8.9 and by increasing the exposure period, however, the number of roots is affected only by increasing the exposure period in the NaOCl solution.

Morphological characteristics and cell viability of coffee plants calli / Características morfológicas e viabilidade celular de calos de cafeeiro

The aim of this research was to characterize and compare two types of calli from leaf explants of Coffea arabica (cultivar Catiguá). Cells of different types of callus were successfully characterized regarding viability and internal and external morphological characteristics. It was obtained two morphologically distinct types of callus: (i) yellow friable and (ii) transparent watery. The yellow friable calli showed higher cell viability and embryogenic characteristics. Scanning and transmission electron microscopy showed embryogenic characteristics in cells of the yellow friable calli evidenced by the presence of small and isodiametric cells, while transparent watery calli showed elongated cells and large cytoplasm vacuolization.

O objetivo deste trabalho foi caracterizar e comparar dois tipos de calos de explantes foliares de Coffea arabica (cultivar Catiguá). Células de diferentes tipos de calos foram caracterizadas quanto a viabilidade e características morfológicas externas e internas. Foram obtidos dois tipos de calos morfologicamente distintos: (a) amarelo friável e (b) transparente aquoso. Os calos amarelos friáveis apresentaram maior viabilidade celular e características embriogênicas. Microscopia eletrônica de varredura e transmissão mostraram características embriogênicas em calos amarelos friáveis evidenciadas pela presença de células pequenas e isodiamétricas. Os calos transparentes aquosos apresentaram células alongadas e vacuolizadas.

Effects of cytokinins onin vitro mineral accumulation and bud development in Annona glabra L. / Efeito de citocininas sobre o acúmulo de minerais e desenvolvimento de brotações de Annona glabra L. in vitro

Annona glabra is a tropical species that has significant agronomic potential in terms of furnishing fruits for in natura consumption and for the production of phyto-pharmaceuticals. In vitro cultivation has been considered the most promising form of propagation for this species, although large scale utilization of this technique is currently limited by high rates of leaf abscission, reduced rates of explant multiplication and slow bud growth. The present work evaluated the effects of different cytokinins on mineral accumulation in shoots of A. glabra cultivated in vitro, and their effects on growth and survival of these plants. Buds of A. glabra were cultivated in Wood Plant Medium (WPM) in the presence of 6-benzilaminopurine (BAP), thidiazuron (TDZ), kinetin (KIN), and zeatin (ZEA). KIN and BAP use resulted in the greatest growth, largest accumulation of dry mass and leaf area development, as well as the greatest survival rate during in vitro cultivation of this species. All cytokinins tested stimulated large accumulations of nitrogen and boron in shoots, but diminished levels of calcium as compared to controls.

Annona glabra é uma espécie frutífera tropical que apresenta elevado potencial agronômico pelo fornecimento de frutos para o consumo in natura e pela produção de fitofármacos. O cultivo in vitro tem sido preconizado como a forma mais adequada de propagação para essa espécie, embora sua utilização em larga escala ainda seja limitada pela elevada taxa de abscisão foliar, reduzida taxa de multiplicação dos explantes e crescimento lento das brotações. Objetivou-se, neste trabalho, avaliar o efeito de citocininas sobre o acúmulo de minerais nas brotações de A. glabra cultivadas in vitro e seus reflexos sobre o crescimento e sobrevivência das plantas nesse tipo de ambiente. Brotações de A. glabra foram cultivadas em meio Wood Plant Medium (WPM), na presença de 6-benzilaminopurina (BAP), thidiazuron (TDZ), cinetina (KIN) e zeatina (ZEA). A utilização de KIN e BAP induziu maior crescimento, maior acúmulo de massa seca, maior desenvolvimento da área foliar e maior taxa de sobrevivência das plantas durante o cultivo in vitro dessa espécie. Todas as fontes de citocininas testadas estimularam maiores acúmulos de nitrogênio e boro nas brotações e menores de cálcio.

Ajuste do processo de micropropagação de barbatimão / Adjustment of the process of micropropagation of Stryphnodendron adstringens (Mart.) Coville

O objetivo desta pesquisa foi determinar um protocolo de micropropagação para o barbatimão. Para indução de brotações, os segmentos nodais foram inoculados em meio de cultura MS com diferentes concentrações de cinetina (0, 1, 2, 3, 4 e 5mg L-1). Para indução de raízes, brotações obtidas "in vitro" foram inicialmente transferidas para meio MS contendo 50 por cento da concentração de sais e com diferentes concentrações de ANA (0, 1, 2, 3 e 4mg L-1). Posteriormente, as brotações foram transferidas para meio MS contendo 50 por cento da concentração de sais, suplementado com carvão ativado. Para a aclimatização, as plantas obtidas foram transferidas para tubetes contendo diferentes substratos e, então, envolvidas com saco plástico transparente para auxiliar temporariamente na manutenção da umidade. As concentrações de 1 e 5mg L-1 de cinetina foram as mais eficientes na indução de gemas e brotos, respectivamente. Brotações com maiores comprimentos foram observadas em meio de cultura suplementado com 1mg L-1 de cinetina. Raízes em maior número e comprimento foram observados em meio de cultura suplementado com 4mg L-1 de ANA. Os substratos utilizados não afetaram significativamente a taxa de sobrevivência das plantas durante a fase de aclimatização.

The objective of the research was to determine a micropropagation protocol for the specie Stryphnodendron adstringens (Mart.) Coville. For shoot induction, nodal segments were inoculated in MS medium with different concentrations of kinetin (0, 1, 2, 3, 4 e 5mg L-1). For root induction, initially the shoots obtained 'in vitro' were transferred to MS containing 50 percent of salt concentration and with different concentrations of NAA (0, 1, 2, 3 e 4mg L-1). Lately, the shoots were moved to MS medium containing 50 percent of salt concentration, supplemented with activated charcoal. For acclimatization, the plants obtained were moved to plastic tubes containing different substrates and then covered with transparent plastic bags in order to maintain the environment humidity. The kinetin concentrations of 5.0 and 1.0mg L-1 were the most efficient for the induction of shots and buds, respectively. Shoot with a higher lengh were observed in MS medium supplemented with 1.0mg L-1 of kinetin. Roots in a higher number and length were observed in MS medium supplemented with 4.0mg L-1 of NAA. The substrates used had no significant effect on the rate of plant survival during the acclimatization stage.

Germinação in vitro e ex vitro de Inga vera Willd. subsp. affinis (DC.) T.D. Penn. / Germination in vitro and ex vitro of Inga vera Willd. subsp. affinis (DC.) T.D. Penn

O Inga vera Will subsp. affinis (DC). T.D. Penn. é uma espécie frutífera nativa do Cerrado, importante na recuperação de matas ciliares degradadas. Entretanto, apresenta sua propagação dificultada pelo fato de suas sementes serem recalcitrantes, ou seja, não tolerarem a perda de água. O objetivo deste trabalho foi estudar aspectos da germinação ex vitro e in vitro de ingazeiro. Para tanto, foram avaliados os efeitos de diferentes substratos: areia, Plantmax® e Areia+ Plantmax®; diferentes concentrações de sais: WPM, WPM/2, MS e MS/2, e diferentes concentrações de GA3 (0, 5, 10, 17 e 20 µM) no meio de cultura. Observou-se que, na germinação ex vitro, o substrato Plantmax® proporcionou maior porcentagem de germinação (82 por cento). Com relação à germinação in vitro, a maior percentagem de germinação foi obtida utilizando-se meio de cultura WPM/2 (96 por cento). A adição de GA3 no meio de cultura não foi estatisticamente significativa, no entanto, a concentração de 20 µM de GA3 proporcionou um aumento na germinabilidade de sementes de ingazeiro.

The Inga vera Will subsp. affinis (DC). T.D. Penn. is fruit native specie from cerrado, commonly for recovering devastated areas. However, its propagation is complicated due to the fact that the seeds are recalcitrant and does not support water loss. The objective of this work was to study Inga vera Willd. subsp. affinis (DC.) T.D. Penn. ex vitro and in vitro germination aspects. For this purpose, different substrates: sand, Plantmax® and sand+ Plantmax®; different salt concentrations: WPM, WPM/2, MS and MS/2, and different GA3 concentrations (0, 5, 10, 17 and 20 µM) were evaluated. The results showed that, in the ex vitro germination, the use of Plantmax® provided the highest germination percentage (82 percent). Regarding the in vitro germination, highest percentage was observed using WPM/2 (96 percent). The addition of GA3 was not statistically significant although the concentration of 20 µM promoted an increase in the germination of Inga vera seeds.