Avaliação do potencial antimicrobiano e citotoxicidade de fragmentos peptídicos catiônicos isolados ou combinados na prevenção da cárie dentária / Cytotoxicity and microbiological effect of cationic peptide fragments isolated or combined for dental caries prevention

RESUMO

O sistema imune tem diversas formas de defesa contra microrganismos patogênicos. As membranas da mucosa são uma fonte de peptídeos catiônicos antimicrobianos contra uma ampla variedade de bactérias, fungos e vírus encapsulados. O objetivo deste estudo foi avaliar a citotoxicidade e atividade antimicrobiana em condições planctônicas e de biofilme de fragmentos derivados de peptídeos catiônicos (PC) LL-37 (originário de hCAP-18), D6-17 e D1-23 (originários de ortólogo da ß-defensina-3 humana) contra bactérias cariogênicas. Para análise citotóxica, duas linhagens de células epiteliais foram expostas a diluições seriadas de fragmentos de PC. Ensaios de MTT e coloração de DAPI foram realizados para avaliar o metabolismo e a morfologia celular, respectivamente. A concentração inibitória mínima (CIM) e a concentração bactericida mínima (CBM) foram determinadas para fragmentos de PC e controle (digluconato de clorexidina - CHX) contra Streptococcus mutans (Sm), S. mitis, S. oralis, S. salivarius, S. sanguinis, Lactobacillus acidophilus, L. casei, L. rhamnosus, L. brevis, L. fermentum e Actinomyces israelii. A concentração inibitória fracionada (FIC) foi obtida pelas combinações de fragmentos de CP para S. mutans. O ensaio de biofilme foi conduzido com CHX e o melhor fragmento de CP contra cepas de S. mutans. Microscopia confocal a laser foi realizada para avaliar a quantidade de células mortas em relação as células vivas e também a espessura do biofilme. Os resultados indicaram que D6-17 não afetou o metabolismo de nenhuma das linhagens celulares. D1-23, LL37 e CHX não foram tóxicos para ambas as células utilizadas, quando de concentrações abaixo de 0,2, 0,02 e 0,01mM, respectivamente. Combinações dos PC não mostraram efeito sinérgico contra S. mutans. A coloração DAPI demonstrou fragmentação nucleica para LL-37 e CHX, e aspecto semelhante ao controle (meio de cultura) para D1-23 e D6-17. D1-23 apresentou a melhor atividade bactericida contra S. mutans, S. mitis e S. salivarius. LL-37 apresentou melhor efeito contra espécies de Lactobacillus e Actinomyces. D6-17 mostrou atividade bactericida apenas contra S. mutans, L. brevis e L. fermentum. Combinações de fragmentos de PC não mostraram efeito sinérgico contra S. mutans. D1-23 (10x CBM) apresentou atividade contra biofilme de S. mutans superior a CHX. A microscopia confocal mostrou alta taxa de células mortas em relação a células vivas para D1-23 e CHX quando comparado ao grupo controle (meio de cultura). D1-23 também diminuiu a espessura do biofilme em relação ao grupo controle. Conclui-se que D1-23 mostrou relevante atividade antimicrobiana/antibiofilme contra bactérias cariogênicas e baixa toxicidade em células epiteliais(AU)

ABSTRACT

The immune system has several forms of defense against pathogenic microorganisms. The mucous membranes are a source of potent antimicrobial cationic peptides against a broad range of bacteria, fungi and enveloped viruses. The aim of study was evaluated the cytotoxicity and antimicrobial activity under planktonic and biofilm conditions of fragments derived from cationic peptides (CP) LL-37 (from hCAP-18), D6-17 and D1-23 (from ß-defensin-3 derivative) against cariogenic bacteria. For cytotoxicity analysis, two lines of epithelial cells were exposed to serial dilutions of the CP fragments. MTT assays and DAPI staining were performed to evaluate cell metabolism and morphology, respectively. Minimum inhibitory concentration (MIC) and minimal bactericidal concentration (MBC) were determined for the CP fragments and control (Chlorhexidine digluconate-CHX) against Streptococcus mutans (Sm), S. mitis, S. oralis, S. salivarius, S. sanguinis, Lactobacillus acidophilus, L. casei, L. rhamnosus, L. brevis, L. fermentum and Actinomyces israelii. Fractional inhibitory concentration (FIC) was obtained for the combinations of CP fragments on S. mutans. Biofilm assays were conducted with CHX and the best antimicrobial CP fragment against S. mutans strains. Confocal Laser Scanning Microscopy (CLSM) was used to analyze the Live/Dead cells and biofilm thickness. The results indicated that D6-17 did not affect the metabolism of either cell line. D1-23, LL-37 and CHX were not toxic for both cells, in concentrations below 0.2, 0.02 and 0.01mM, respectively. DAPI-staining cells demonstrated nuclei fragmentation for LL-37 group and cells with the aspect of apoptosis in the CHX group. Cells treated with D1-23 and D6-17 presented morphology similar to the control group (culture medium). D1-23 presented the best bactericidal activity against S. mutans, S. mitis and S. salivarius. LL-37 had a better effect against Lactobacillus and Actinomyces species. D6-17 showed bactericidal activity only against S. mutans, L. brevis and L. fermentum. Combinations of CP fragments did not show a synergic effect against S. mutans. D1-23 (10x MBC) presented a higher effect against S. mutans biofilm compared to CHX. CLSM analysis showed that D1-23 and CHX groups presented higher quantification of dead cells when compared to control (culture medium). The biofilm thickness were lower in the D1-23 group compared to CHX and control groups. We concluded that D1-23 showed a remarkable antimicrobial/anti-biofilm effect against cariogenic bacteria and low toxicity for epithelial cells(AU)