Fast screening of enteropathogens in marine water samples.

This study aimed to fast screen the microbiological contamination of recreational waters using a TaqMan Array Card (TAC), a multiplexed platform designed for the simultaneous detection of 35 enteropathogens. Surface and deep marine water samples were concentrated by skimmed milk flocculation and processed for nucleic acid extraction protocol using QIAamp Fast DNA Stool Mini Kit. Twelve microorganisms and parasites, including bacteria (n = 6), protozoa (4), and viruses (2), were detected in 85.7% (24/28) of samples. Campylobacter (82.1%), Cryptosporidium (39.3%), and adenovirus (14.3%) were the most detected pathogens. Neither fungi nor helminths were detected. A spatial pollution profile of microbiological contamination was observed in the area. Methodologies for simultaneous detection of multiple pathogens, such as TAC, can assist decision-makers by providing a quick assessment of the microbiological water quality in areas used for recreational purposes, which in many cases are in accordance with the bacteriological indicators.

Detection and molecular characterization of human group C rotavirus in Brazil.

OBJECTIVE: The aim of the present study was to characterize 24 isolates of group C rotavirus (RV-C) by analysis of DNA sequences of the VP4, VP6, VP7 and NSP4 genes of several Brazilian states. METHODS: All RV-C strains were confirmed by polyacrylamide gel electrophoresis and were characterized by sequence and phylogenetic analysis of the genes encoding NSP4, VP6, VP4, and VP7 proteins. RESULTS: Analysis of the NSP4 gene from Brazilian strains revealed that the isolates are more closely related to each other than to those of other strains previously published. The VP6 gene showed high homology to Indian strains. The sequences of VP4 and VP7 genes showed two lineages circulating in Brazil in the same region and at the same time. CONCLUSION: These results confirm the transmission of RV-C in Brazil. RV-C infection appears to occur occasionally despite the low detection rate of the virus.

Microbiological assessment of an urban lagoon system in the coastal zone of Rio de Janeiro, Brazil.

This study aims to assess microbiological contamination using a molecular tool for detection of multiple enteropathogens in a coastal ecosystem area in Rio de Janeiro, Brazil. Ten litres of superficial water samples were obtained during the spring ebb tide from sampling sites along the Jacarepaguá watershed. Samples were concentrated using skimmed milk flocculation method for TaqMan array card (TAC), designed to identify 35 enteric pathogens simultaneously, and single TaqMan qPCR analysis for detecting human adenovirus (HAdV) and JC human polyomavirus (JCPyV) as faecal indicator viruses (FIV). TAC results identified 17 enteric pathogens including 4/5 viral species investigated, 8/15 bacteria, 4/6 protozoa and 1/7 helminths. Escherichia coli concentration was also measured as faecal indicator bacteria (FIB) using Colilert Quanti-Tray System with positivity in all samples studied. HAdV and JCPyV qPCR were detected in 8 and 4 samples, respectively, with concentration ranging from 8 × 102 to 2 × 106 genome copies/L. Partial nucleotide sequencing demonstrated the occurrence of species HAdV A, C, D, and F, present in faeces of individuals with enteric and non-enteric infections, and JCPyV type 3 (Af2), prevalent in a high genetically mixed population like the Brazilian. The diversity of enteropathogens detected by TAC emphasizes the utility of this methodology for quick assessment of microbiological contamination of the aquatic ecosystems, speeding up mitigation actions where the risk of the exposed population is detected, as well as pointing out the infrastructure gaps in areas where accelerated urban growth is observed.

Rotavirus genotype distribution after vaccine introduction, Rio de Janeiro, Brazil.

Brazil introduced rotavirus vaccination in March 2006. We studied 133 rotavirus-positive fecal samples collected from February 2005 through December 2007. Genotype G2P[4] was found in 1.4% of samples in 2005, in 44% in 2006, and in 96% in 2007. Rotavirus detection rate decreased from 38% in 2005 to 24% in 2007 (p = 0.012).

Development of a rapid and sensitive latex agglutination-based method for detection of group A rotavirus.

Considering the background of morbidity and mortality caused by human rotavirus, detection methods that use rotavirus group antigen (VP6) in either enzyme immunoassay (EIA) or latex agglutination test (LAT) has been employed routinely in clinical diagnostic and epidemiological studies. In order to develop a rapid and sensitive rotavirus group A LAT, part of segment 6 corresponding to conserved N-terminal portion of the VP6 (1-245 aa) was cloned in Escherichia coli expression pGEX vector (glutathione S-transferase-GST gene fusion system) that has been modified previously containing a histidine tail at C-terminus. The immunological propriety of the recombinant VP6 having a total molecular weight of 52 kDa was evaluated by Western blot and by the ability of inducing anti-recombinant VP6 polyclonal antibodies in rabbit. The polyclonal serum produced was conjugated to a latex support to detect rotavirus in stool specimens. The percentage values for sensitivity and specificity of the rotavirus group A LAT were 98.5% and 100%, respectively.

Molecular analysis of the NSP4 and VP6 genes of rotavirus strains recovered from hospitalized children in Rio de Janeiro, Brazil.

Group A rotaviruses are the main cause of acute gastroenteritis in children throughout the world. The two outer capsid proteins, VP4 and VP7, define the P and G genotypes, respectively. Rotaviruses with P[8]G1, P[4]G2, P[8]G3 and P[8]G4 genotypes are predominant in infecting humans and the G9 genotype is emerging in most continents as the fifth most common G type worldwide. The inner capsid protein VP6 is responsible for subgroup (SG) specificities, allowing classification of rotaviruses into SG I, SG II, SG I+II and SG non-I-non-II. The non-structural protein 4 (NSP4) encoded by segment 10 has a role in viral morphogenesis and five genetic groups have been described, NSP4 genotypes A-E. The aim of this investigation was to characterize the NSP4 and VP6 genes of rotavirus strains recovered from hospitalized children. Thirty rotavirus strains were submitted to RT-PCR followed by sequencing and phylogenetic analysis. Among the different G and P genotype combinations, two distinct genetic groups could be recognized for the NSP4 gene. Twenty-eight clustered with NSP4 genotype B. The two P[4]G2 strains fell into NSP4 genotype A and clustered distinctly, with a 100 % bootstrap value. The strains distinguished within a group were closely related to each other at the nucleotide and amino acid levels. A phylogenetic tree was constructed for the VP6 gene including the human strains RMC100, E210, Wa, US1205 and 1076, and the animal strains Gott, NCDV, SA-11, FI-14 and EW. This is the first report on Brazilian rotavirus strains describing NSP4 genotype A strains associated with VP6 SG I, and NSP4 genotype B strains associated with VP6 SG II.

Brazilian P[8],G1, P[8],G5, P[8],G9, and P[4],G2 rotavirus strains: nucleotide sequence and phylogenetic analysis.

Rotavirus epidemiological surveys with molecular analysis of strains are required for gastroenteritis control and prevention. Twenty-nine human rotavirus strains detected in Rio de Janeiro, Brazil, from 1986 to 2004 were characterized as P[8],G1, P[8],G5, P[8],G9, and P[4],G2 genotypes. The VP7 genes were sequenced and phylogenetic analysis was performed. Strains of genotype G1 revealed two distinct lineages, G1-3 and G1-4; strains of genotype G2 grouped in lineage G2-1; G5 strains clustered with other Brazilians G5 strains and G9 strains were closely related to each other in lineage G9-3, distinct from the original G9 strains detected in 1980s. The VP4 genes were analyzed and P[8] strains fell into two major genetic lineages, P[8]-2 and P[8]-3. Our findings document an intragenotype diversity represented by lineages and sublineages within rotavirus circulating in Rio de Janeiro from 1986 to 2004, before application of a vaccine (Rotarix) in Brazil. This report emphasizes the importance of continuing monitor genotypes to verify if uncommon strains or newly strains are emerging to be specifically addressed in future vaccine trials.

Rotavirus strain diversity in Rio de Janeiro, Brazil: characterization of VP4 and VP7 genotypes in hospitalized children.

Rotavirus strains from 91 patients treated at a children's hospital from 1996 to 1998 in Rio de Janeiro, Brazil, were characterized by electropherotyping, reverse transcription-PCR amplification for P and G genotypes, and Southern hybridization. Results obtained showed that following predominant [P],G type combination: P[4], G2 (21 per cent), P[8], G1 (17 per cent), P[8], G3 (13 per cent), which are prevalent throughout the world. However, an unexpected number of cases were associated with uncommon genotypes: P[8], G2 (13 per cent), P[8], G5 (11 per cent), P[8], G9 (7 per cent), P[8], G10 (4 per cent), P[6], G4 (3 per cent), P[6], G3 (1 per cent), P[4], G9 (1 per cent), and P[6], G9 (1 per cent). Mixed infections with more than one type were identified in only two cases and 16 per cent of the samples were not G and/or P typeable. A subset of G types was confirmed by Southern hybridization and chemiluminescent detection. Rotavirus seasonal distribution was observed between April and July. The contribution of the results obtained in the present investigation corroborates the required epidemiological surveillance for rotavirus infection in Brazil.

Caracterização dos genes vp4, vp6, vp7 e nsp4 de rotavírus a em casos de gastroenterite aguda em crianças hospitalizadas no Rio de Janeiro, 1986-2004

A primeira associação dos vírus como agentes etiológicos da gastroenterite foi feita em 1972 por Kapikian e colaboradores que, pela microscopia eletrônica, identificaram o vírus Norwalk e estabeleceram sua associação com a gastroenterite em jovens e adultos. Estudos posteriores revelaram a grande importância dos vírus na etiologia da diarréia, destacando-se entre eles, os Rotavírus humanos (RV). Os RV são transmitidos principalmente via fecal-oral e atualmente representam são um dos mais importantes agentes etiológicos da gastroenterite infantil aguda. A classificação dos RV é feita com base em estudos moleculares dos genes VP4 e VP7, que caracterizam os genótipos P e G, respectivamente. É utilizada a reação em cadeia pela polimerase precedida de transcrição reversa (RT-PCR) e reações de semi-nested PCR ou ainda o seqüenciamento de amplicons consensuais obtidos das regiões dos genes VP4 e VP7. Os genótipos P[8]G1, P[4]G2, P[8]G3 e P[8]G4 representam os mais comuns na maior parte do mundo, entretanto genes que codificam outras proteínas também estão sendo estudados a fim de se ampliar o conhecimento do papel de cada um destes no processo de infecção e estabelecimento da doença A proteína estrutural VP6 é a responsável pela definição de grupo e especificidade de subgrupo, sendo os RV do grupo A epidemiologicamente os mais importantes e os principais responsáveis pelos episódios de diarréia infantil aguda em todo mundo. A proteína não-estrutural NSP4 é uma glicoproteína que tem participação no processo de maturação dos RV e já foi proposta como enterotoxina viral. Essas características fazem das proteínas VP6 e NSP4 alvo de nosso estudo de seqüenciamento e análise filogenética, juntamente com as proteínas VP4 e VP7. Os dados a serem obtidos no estudo individual dessas proteínas podem esclarecer o perfil de infecção e gravidade da doença, trazendo informações úteis para o monitoramento de vacinas anti-RV.

Caracterizaçäo molecular de rotavírus do grupo A em amostras fecais de crianças hospitalizadas com gastroenterite aguda no Rio de Janeiro

Os rotavírus (RV) säo considerados os principais agentes etiológicos da gastroenterite viral aguda na populaçäo infantil com idade inferior a três anos de idade. Assumem uma significância especial nos países em desenvolvimento, onde estima-se que esses vírus sejam responsáveis por 680 mil mortes/ano. Os sorotipos de RV säo definidos pelas duas proteínas do capsídeo externo, VP4 e VP7, as quais induzem a produçäo de anticorpos neutralizantes tipo-específicos e säo utilizadas para classificar os RV em G (VP7) e P(VP4) sorotipo/genotipos. No período de Maio de 1996 a Dezembro de 1998, foram coletadas e analisadas 115 amostras fecais de crianças hospitalizadas com quadro de gastroenterite aguda em dois Hospitais Municipais do Rio de Janeiro-RJ. O dsRNA extraído foi submetido a eletroforese em gel de poliacrilamida (EGPA) e 79 por cento das amostras foram positivas para RV grupo A. Após esta análise, foram submetidas a uma reaçäo de amplificaçäo genômica precedida de transcriçäo reversa (RT-PCR), seguida de Nested-PCR, para se determinar os genotipos presentes. Entre os genotipos comuns encontrados, P[4]G2 foi predominante em 21 por cento das amostras, e um grupo com percentual total de 35 por cento foi representado pelos genotipos P[8]G1, P[8]G3 e P[8]G4. Da mesma forma, genotipos incomuns foram detectados, sendo eles: P[8]G2 (13por cento), P[8]G5 (11por cento), P[8]G9 (7por cento), P[8]G10 (4 por cento), P[6]G4 (3por cento), P[4]G9 (1por cento) , P[6]G9 (1por cento), P[4+8]G3 (1por cento). Foi possível a caracterizaçäo de 81 (89 por cento) genotipos G e 83 (91por cento) genotipos P. A técnica de hibridizaçäo molecular confirmou a especificidade genotípica nos resultados obtidos pela RT-PCR e nested-PCR em relaçäo às amostras G5 e G9, fato este näo ocorrido nas amostras caracterizadas como G10. O seqüenciamento dessas amostras revelou homologia ao genotipo G3 humano, o que foi confirmado por hibridizaçäo com a sonda específica para este genotipo. Tal fato vem reforçar o conceito de genotipos reestruturados, que säo interespécies e infecçöes mistas. Este trabalho descreve pela primeira vez a presença do genotipo G9 no Brasil e ressalta sua importância epidemiológica, como demonstrada em outros países. O percentual de amostras näo tipadas (16 por cento) levanta a possibilidade de genotipos adicionais estarem sendo disseminados. É importante a caracterizaçäo molecular dessas amostras, uma vez que novos genotipos podem surgir como predominantes no futuro. (AU)

Caracterizaçäo molecular de rotavírus do grupo A em amostras fecais de crianças hospitalizadas com gastroenterite aguda no Rio de Janeiro

Os rotavírus (RV) säo considerados os principais agentes etiológicos da gastroenterite viral aguda na populaçäo infantil com idade inferior a três anos de idade. Assumem uma significância especial nos países em desenvolvimento, onde estima-se que esses vírus sejam responsáveis por 680 mil mortes/ano. Os sorotipos de RV säo definidos pelas duas proteínas do capsídeo externo, VP4 e VP7, as quais induzem a produçäo de anticorpos neutralizantes tipo-específicos e säo utilizadas para classificar os RV em G (VP7) e P(VP4) sorotipo/genotipos. No período de Maio de 1996 a Dezembro de 1998, foram coletadas e analisadas 115 amostras fecais de crianças hospitalizadas com quadro de gastroenterite aguda em dois Hospitais Municipais do Rio de Janeiro-RJ. O dsRNA extraído foi submetido a eletroforese em gel de poliacrilamida (EGPA) e 79 por cento das amostras foram positivas para RV grupo A. Após esta análise, foram submetidas a uma reaçäo de amplificaçäo genômica precedida de transcriçäo reversa (RT-PCR), seguida de Nested-PCR, para se determinar os genotipos presentes. Entre os genotipos comuns encontrados, P[4]G2 foi predominante em 21 por cento das amostras, e um grupo com percentual total de 35 por cento foi representado pelos genotipos P[8]G1, P[8]G3 e P[8]G4. Da mesma forma, genotipos incomuns foram detectados, sendo eles: P[8]G2 (13por cento), P[8]G5 (11por cento), P[8]G9 (7por cento), P[8]G10 (4 por cento), P[6]G4 (3por cento), P[4]G9 (1por cento) , P[6]G9 (1por cento), P[4+8]G3 (1por cento). Foi possível a caracterizaçäo de 81 (89 por cento) genotipos G e 83 (91por cento) genotipos P. A técnica de hibridizaçäo molecular confirmou a especificidade genotípica nos resultados obtidos pela RT-PCR e nested-PCR em relaçäo às amostras G5 e G9, fato este näo ocorrido nas amostras caracterizadas como G10. O seqüenciamento dessas amostras revelou homologia ao genotipo G3 humano, o que foi confirmado por hibridizaçäo com a sonda específica para este genotipo. Tal fato vem reforçar o conceito de genotipos reestruturados, que säo interespécies e infecçöes mistas. Este trabalho descreve pela primeira vez a presença do genotipo G9 no Brasil e ressalta sua importância epidemiológica, como demonstrada em outros países. O percentual de amostras näo tipadas (16 por cento) levanta a possibilidade de genotipos adicionais estarem sendo disseminados. É importante a caracterizaçäo molecular dessas amostras, uma vez que novos genotipos podem surgir como predominantes no futuro. (AU)