Differential cellular immune response of Galleria mellonella to Actinobacillus pleuropneumoniae.

In the present work, we have investigate the cellular immune response of Galleria mellonella larvae against three strains of the gram-negative bacterium Actinobacillus pleuropneumoniae: low-virulence (780), high-virulence (1022) and the serotype 8 reference strain (R8). Prohemocytes, plasmatocytes, granulocytes, oenocytoids and spherulocytes were distinguished according to their size and morphology, their molecular markers and dye-staining properties and their role in the immune response. Total hemocyte count, differential hemocyte count, lysosome activity, autophagic response, cell viability and caspase-3 activation were determined in circulating hemocytes of naive and infected larvae. The presence of the autophagosome protein LC3 A/B within the circulating hemocytes of G. mellonella was dependent on and related to the infecting A. pleuropneumoniae strain and duration of infection. Hemocytes treated with the high-virulence strain expressed higher levels of LC3 A/B, whereas treatment with the low-virulence strain induced lower expression levels of this protein in the cells. Moreover, our results showed that apoptosis in circulating hemocytes of G. mellonella larvae after exposure to virulent bacterial strains occurred simultaneously with excessive cell death response induced by stress and subsequent caspase-3 activation.

Characterization of small extracellular vesicles released by human primary macrophages and their ability to propagate resistance to HIV-1 replication

Vesículas extracelulares (VEs) são liberadas por virtualmente todos os tipos de células, e participam da comunicação intercelular por meio do transporte e transferência de moléculas bioativas, como ácidos nucléicos, proteínas, lipídios e moléculas de sinalização, para células receptoras. Nesta tese, nós nos aventuramos por alguns dos desafios atuais no campo das VEs, indo desde o isolamento e caracterização de pequenas sVEs (sVEs) secretadas por macrófagos humanos primários, até o estudo do seu papel na patogênese da infecção pelo vírus da imunodeficiência humana tipo 1 (HIV-1). Até o momento, não há trabalhos metodológicos publicados mostrando em detalhes o isolamento, caracterização e internalização de sVEs liberadas por macrófagos primários humanos derivados de monócitos circulantes (sVEs derivados de MDM). Um dos nossos objetivos foi propiciar um protocolo alternativo, com base na ultracentrifugação diferencial (dUC), para isolar e caracterizar as sVEs dessas células. Assim, macrófagos derivados de monócitos circulantes foram cultivados em meio livre de vesículas durante 24, 48 ou 72 h, e as VEs foram isoladas dos sobrenadantes da cultura por dUC. Os macrófagos secretaram uma grande quantidade de sVEs nas primeiras 24 h, com tamanho variando entre 40 a 150 nm, com pico em 105 nm, segundo avaliações por nanoparticle tracking analysis (NTA) e microscopia eletrônica de varredura. Os marcadores proteicos Alix, CD63 e CD81 foram detectados por immunoblotting nas amostras de VEs, e a co-localização de CD63 e CD81 após ultracentrifugação por gradiente de densidade de sacarose (S-DGUC) indicou a presença de sVEs de origem endossomal. A microscopia de fluorescência revelou que as sVEs foram internalizadas por macrófagos primários receptores após três horas de co-cultura. Em relação à capacidade das sVEs de propagar resistência anti-HIV-1, vimos que a adição de sVEs às células infectadas diminuiu a replicação do HIV-1 em macrófagos e células mononucleares de sangue periférico (PBMCs), atingindo níveis de inibição de 73% e 74%, respectivamente. As sVEs individuais ou pools dessas vesículas mostraram um efeito inibitório semelhante. Além disso, macrófagos não infectados e expostos ao peptídeo intestinal vasoativo (VIP) liberaram sVEs com atividade anti-HIV-1 em macrófagos ou PBMCs infectados. Encontramos também que o pré-tratamento de PBMCs infectados com HIV-1 com heparina reverteu em quase 80% o efeito antiviral mediado pelas sVEs, sugerindo que as vesículas transferiram a resistência ao HIV-1 para as células receptoras de uma maneira dependente de endocitose mediada por proteoglicanos de heparam sulfato. Nossos dados sugerem que as sVEs derivadas de MDM podem atuar como um componente importante na imunidade inata mediada por macrófagos contra a infecção pelo HIV-1. Acreditamos que as sVEs derivadas de MDM (expostos ou não com VIP) não infectados funcionam como um veículo para transportar mediadores capazes de controlar a replicação viral em células receptoras infectadas pelo HIV- 1. Nossos resultados contribuem para a compreensão do papel das VEs de macrófagos na infecção pelo HIV-1, e abrem o caminho para estudos mecanísticos mais profundos e para novas estratégias terapêuticas baseadas nas sVEs