RESUMO
Proteins' extraordinary performance in recognition and catalysis has led to their use in a range of applications. However, proteins obtained from natural sources are oftentimes not suitable for direct use in industrial or diagnostic setups. Natural proteins, evolved to optimally perform a task in physiological conditions, usually lack the stability required to be used in harsher conditions. Therefore, the alteration of the stability of proteins is commonly pursued in protein engineering studies. Here, we achieved a substantial thermal stabilization of a bacterial Zn(II)-dependent phospholipase C by consensus sequence design. We retrieved and analyzed sequenced homologues from different sources, selecting a subset of examples for expression and characterization. A non-natural consensus sequence showed the highest stability and activity among those tested. Comparison of the stability parameters of this stabilized mutant and other natural variants bearing similar mutations allows us to pinpoint the sites most likely to be responsible for the enhancement. Point mutations in these sites alter the unfolding process of the consensus sequence. We show that the stabilized version of the protein retains full activity even in harsh oil degumming conditions, making it suitable for industrial applications.
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Proteínas , Zinco , Sequência de Aminoácidos , Proteínas/metabolismo , Mutação , Sequência ConsensoRESUMO
BACKGROUND: Metabolomics plays a critical role in deciphering metabolic alterations within individuals, demanding the use of sophisticated analytical methodologies to navigate its intricate complexity. While many studies focus on single biofluid types, simultaneous analysis of multiple matrices enhances understanding of complex biological mechanisms. Consequently, the development of data fusion methods enabling multiblock analysis becomes essential for comprehensive insights into metabolic dynamics. RESULTS: This study introduces a novel guideline for jointly analyzing diverse metabolomic datasets (serum, urine, metadata) with a focus on metabolic differences between groups within a healthy cohort. The guideline presents two fusion strategies, 'Low-Level data fusion' (LLDF) and 'Mid-Level data fusion' (MLDF), employing a sequential application of Multivariate Curve Resolution with Alternating Least Squares (MCR-ALS), linking the outcomes of successive analyses. MCR-ALS is a versatile method for analyzing mixed data, adaptable at various stages of data processing-encompassing resonance integration, data compression, and exploratory analysis. The LLDF and MLDF strategies were applied to 1H NMR spectral data extracted from urine and serum samples, coupled with biochemical metadata sourced from 145 healthy volunteers. SIGNIFICANCE: Both methodologies effectively integrated and analysed multiblock datasets, unveiling the inherent data structure and variables associated with discernible factors among healthy cohorts. While both approaches successfully detected sex-related differences, the MLDF strategy uniquely revealed components linked to age. By applying this analysis, we aim to enhance the interpretation of intricate biological mechanisms and uncover variations that may not be easily discernible through individual data analysis.
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Metabolômica , Humanos , Metabolômica/métodos , Masculino , Feminino , Análise Multivariada , Voluntários Saudáveis , Adulto , Espectroscopia de Prótons por Ressonância Magnética , Estudos de Coortes , Pessoa de Meia-Idade , Análise dos Mínimos Quadrados , Adulto JovemRESUMO
El objetivo de este estudio fue investigar las propiedades reológicas de los glóbulos rojos sometidos a tensiones pulsantes (reología completa), es decir, en condiciones más próximas a las fisiológicas. La reología compleja demostró su alta sensibilidad para detectar anormalidades estructurales en cuerpos viscoelásticos, tales como sangre o eritrocitos. En este trabajo, las propiedades viscoelásticas complejas eritrocitarias fueron evaluadas con un Erotrodefórmetro, construido en este laboratorio, el cual aplica el método difractométrico en suspensiones de glóbulos rojos cizalladas. Tensiones de corte sinusoidales de frecuencia y amplitud controladas, son aplicadas a la suspensión celular. La elongación de los eritrocitos sigue las variaciones de la tensión, pero con un desfasaje angular Ù que es función de la frecuencia y de las propiedades reológicas de las células. Las variaciones de elongación se reproducen en el patrón de difracción laser y son fotométricamente medidas, digitalizadas y almacenadas para su posterior procesamiento. El procesamiento numérico de los datos experimentales conduce a la evaluación de los parámetros viscoelásticos complejos (Ù, n', n", G', G"). Los resultados obtenidos demuestran que la ektacitometría es un excelente método para analizar la reología compleja eritrocitaria y puede ser aplicado con éxito en Hemorreología Clínica para detectar anormalidades celulares patológicas
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Humanos , Deformação Eritrocítica/fisiologia , Hemorreologia/instrumentação , Eritrócitos/fisiologia , Hemorreologia , Hemorreologia/normasRESUMO
Se definen como A intermedio (Aint) los hematíes que comparten caracteres con A1 y A2. Existen diferencias cualitativas y cuantitativas en los epitopes A. Los hematíes A1 son aglutinados por la lectina de Ulex Europaeus (anti-H), en tanto los hematíes Aint son débilmente aglutinados por ambas de manera inesperada. Se realizó una búsqueda de individuos Aint en una población hospitalaria de acuerdo con la reacción con las lectinas mencionadas. Se evaluó el proceso de aglutinación producida mediante una técnica cinética. Se estudiaron 557 muestras, resultando 285 O (51,1 por ciento), 216 A (38,8 por ciento), 45 B (8,1 por ciento), 8 A1B (1,4 por ciento) y 3 A2B (0,6 por ciento). Las muestras A se subdividieron en 173 A1, (80,2 por ciento), 31 A2 (14,3 por ciento) y 12 Aint (5,5 por ciento). Se observó, en las curvas de cinética, diferencia de reacción entre los hematíes de grupo A1 Aint y A2. Nuestros resultados concuerdan con observaciones previas sobre la marcada heterogeneidad de los hematíes Aint. El reconocimiento de de variantes débiles del grupo A reviste importancia cuando se presentan reacciones transfusionales hemolíticas y en la práctica forense. Importa señalar que el valor de este estudio es relevante, en Inmunogenética Poblacional, por su contribución al conocimiento del mestizaje con poblaciones negras
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Humanos , Genética Populacional , Antígenos de Grupos Sanguíneos/imunologia , Incompatibilidade de Grupos Sanguíneos/etiologia , Biomarcadores/análise , Biomarcadores/sangue , Sistema ABO de Grupos Sanguíneos/análise , Sistema ABO de Grupos Sanguíneos/imunologia , Transfusão de Sangue/efeitos adversosRESUMO
El estudio de la agregación eritrocitaria cobra importancia en la medida que permita cuantificar anormalidades circulatorias en diversas patologías. En condiciones normales los glóbulos rojos (GR) se agregan en estructuras cilíndricas denominadas rouleaux, mientras que en condiciones anormales, los agregados adoptan formas irregulares con tendencia morfológica esferoidal. Estas formas anómalas pueden ser inducidas por alteraciones celulares (disminución del contenido de ácido siálico de las glicoproteínas), o por factores extracelulares. El objetivo de éste trabajo fue estudiar la adhesión eritrocitaria relacionada con patologías asociadas a glicoforina A portadora de los antígenos MN de grupos sanguíneos eritrocitarios mediante metodología no convencional. Se estudió la morfología de los agregados eritrocitarios de 36 pacientes diabéticos, 20 pacientes hipertensos, 40 individuos sanos y GR con tratamiento enzimático a distintos tiempos. La agregación se cuantificó con un parámetro de forma de los agregados, denominado ASP (Aggregate Shape Parameter), definido como la relación entre el área proyectada de los agregados y el cuadrado de su perímetro. Los datos fueron obtenidos con muestras de suspensiones de GR en plasma autálogo, al 2 por ciento de hematocrito, las cuales fueron observadas con una cámara CCD (Camera Coupled Digital) y procesadas numéricamente con un procesador digital de imágenes (DIP), ambos acoplados a un microscopio invertido. Las glicoforinas (GP) portadoras de los antígenos M y N, juegan un papel estructural en la preservación de la forma del GR. Esto está ligado a la gran cantidad de ácido siálico (AS) que contienen, el que confiere al eritrocito, una carga negativa. Al aumentar el tiempo de incubación de la tripsina con los GR se produce una desialización progresiva de las GP de la membrana. Como consecuencia de ello se observa la formación de clusters (agregados irregulares) que llevan a valores progresivamente aumentados del ASP. Los pacientes diabéticos (ASP = 0,65 ñ 0,18) e hipertensos (ASP = 0,69 ñ 0,19) presentan valores significativamente mayores (p<10-5) que los controles normales (ASP = 0,28 ñ 0,15). Un aumento de la agregación eritrocitaria representa un importante factor de riesgo en el desarrollo de patologías vasculares, con posible deterioro de la microcirculación. En éste sentido, el ASP provee una útil referencia para cuantificar alteraciones en la morfología de los agregados
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Humanos , Agregação Eritrocítica , Glicoforinas , Diabetes Mellitus , Diabetes Mellitus Tipo 1 , Diabetes Mellitus Tipo 2 , HipertensãoRESUMO
Por medio de los parámetros viscoelásticos in vitro se estudiaron las alteraciones reológicas producidas durante el almacenamiento de eritrocitos humanos. Se estudiaron durante 35 días alícuotas semanales de globulos rojos compactados (CG) y de sangre entera (SE) almacenadas en CPD-adenina. Las muestras fueron analizadas utilizando el eritrodefórmetro en régimen estacionario y en régimen oscilante. Se midió la viscosidad sanguínea y plasmática con un viscosímetro cono/plato. La viscosidad sanguínea y el índice de deformabilidad de los eritrocitos se ven alterados con el tiempo de conservación, mostrando un pico máximo a la segunda semana de conservación. Todos los parámetros de viscoelasticidad compleja se modifican también, siendo más notorias estas alteraciones para las mayores frecuencias de oscilación. Todas las determinaciones reológicas realizadas muestran alteraciones en las propiedades estructurales de los eritrocitos almacenados como concentrado globular. Estas alteraciones son menos importantes que las encontradas en la sangre entera almacenada. En consecuencia, es importante evaluar no sólo los componentes celulares sino también el plasma debido al papel predominante que tienen las proteínas plasmáticas an las alteraciones del comportamiento reológico de los eritrocitos durante su almacenamiento.
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Humanos , Transfusão de Sangue , Preservação de Sangue/métodos , Técnicas In Vitro , Índices de Eritrócitos/fisiologia , Plasma , Reologia , Viscosidade Sanguínea/fisiologiaRESUMO
La deformabilidad de los glóbulos rojos es una propiedad que influencia marcadamente la circulación microvascular. Entre los distintos métodos propuestos para medir este valor, el de filtrabilidade eritrocitaria es el más difundido. Otro método, más reciente, es el preconizado por Bessis y colaboradores, basados en el patrón de difracción láser. En nuestros laboratorios hemos desarrollado un nuevo instrumento denominado eritrodefórmetro, basado en el método de difracción, para determinar la deformabilidad de una población de glóbulos rojos cuando se les aplica una tensión de cizallamiento fluido controlada. Presentámos aquí algunos resultados obtenidos con este instrumento y su comparación con los suministrados por el método de filtrabilidad para las mismas muestras
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Humanos , Eritrócitos Anormais , Reologia , UltrafiltraçãoRESUMO
Poblaciones de eritrocitos obtenidos por punción venosa de dadores sanos fueron irradiados con luz blanca linealmente polarizada hasta niveles de 140J/cm**2 y enfrentados luego con antisueros tipificadores del sistema ABO y con una lectina monoespecífica anti-H. Simultáneamente alícuotas de cada muestra fueron mantenidas, en oscuridad, como testigos y luego enfrentadas con los mismos antisueros y lectinas. Los resultados muestran una significativa activación antigénica de las células, aunque diferenciada de acuerdo al grupo del sistema ABO al que pertenecíam. Esta activación resultó máxima para el grupo A y mínima para el AB
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Humanos , Antígenos , Eritrócitos/efeitos da radiação , Soros Imunes , Lasers , Lectinas , Doadores de SangueRESUMO
Se definen como A intermedio (Aint) los hematíes que comparten caracteres con A1 y A2. Existen diferencias cualitativas y cuantitativas en los epitopes A. Los hematíes A, son aglutinados por la lectina de Dolichus biflorus (anti-A1), los A2 por la lectina Ulex europaeus (anti-H), en tanto los hematíes Aint son variablemente aglutinados por ambas de manera inesperada. Se realizó una búsqueda de individuos Aint en una población hospitalaria de acuerdo con la reacción con las lectinas mencionadas evaluando el proceso de aglutinación producida mediante una técnica cinética. Se caracterizó la actividad aglutinante de la lectina de Amaranthus hypochondriacus (específica para N-acetil-D-galactosamina) antes y después de la incubación con saliva A y frente a eritrocitos A1, Aint y A2. Se estudiaron 458 muestras, resultando 242 O (52,8 por ciento), 170 A (37,1 por ciento), 38 B (8,3 por ciento), 5 A1B (1,1 por ciento) y 3 A2B (0,7 por ciento). Las muestras A se subdividieron en 138 A1 (81,2 por ciento), 23 A2 (13,5 por ciento) y 9 Aint (5,3 por ciento). La comparación de las curvas de cinética obtenidos permite diferenciar los hematíes de grupos A1, Aint y A2. Nuestros resultados concuerdan con observaciones previas sobre la marcada heterogeneidad de los hematíes Aint. El reconocimiento de variantes débiles del grupo A reviste importancia cuando se presentan reacciones transfusionales hemolíticas y en la práctica forense. Este estudio es relevante, en inmunogenética poblacional, por su contribución al conocimiento del mestizaje con poblaciones negras.
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Humanos , Aglutinação/fisiologia , Transfusão de Sangue , Eritrócitos/classificação , Antropologia Forense , Antígenos de Grupos Sanguíneos , Imunogenética , Lectinas , Receptores Mitogênicos , Coleta de Amostras Sanguíneas , População Negra/genéticaRESUMO
Red blood cell (RBC) aggregation has been widely studied and its importance is well established in the rheology of microcirculation. RBC aggregation is a major factor responsible for the flow properties of blood. Increased RBC aggregation has been observed in several pathological states. Therefore, the measurement of erythrocyte aggregation is rhealogically important for quantifying flow abnormality in pathological conditions. Normal RBC under low flow or at rest form rouleaux aggregates, while abnormal RBC aggregation may lead to the formation of irregular aggregate structures, which may be induced by cell-associated factors (reduced membrane sialic acid levels) but also by extracellular factors. The main objective of the present investigation was to study RBC aggregate morphology in diabetic patients, using direct microscopic observation and numerical processing of recorded digitized images. Blood samples were obtained from 20 diabetic patients and from 15 normal control subjects. The aggregate morphology was quantified by the so-called Aggregate Shape Parameter (ASP) defined as the ratio of the aggregate projected area to its square perimeter. ASP appeared higher (p<10 - 5) in diabetic patients (0.65 +/- 0.18) than in normal controls (0.28 +/- 0.15). This rheo-optical method based on the theoretical model for rouleaux aggregates provides a useful reference for measuring deviations of RBC aggregate morphology. Increased aggregation of RBC resulting from a decreased sialylation of glycophorins may be an important factor in the development of vascular diseases and in the microcirculation impairment.
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Humanos , Adulto , Pessoa de Meia-Idade , Diabetes Mellitus/sangue , Agregação Eritrocítica , Eritrócitos/ultraestrutura , Doenças Cardiovasculares/etiologia , Estudos de Casos e Controles , Eritrócitos/metabolismo , Eritrócitos/fisiologia , Processamento de Imagem Assistida por Computador , Microscopia , Fatores de RiscoRESUMO
La aglutinación inmunológica es la consecuencia de la reacción Ag-Ac que adhiere eritrocitos adyacentes. Los anticuerpos se fijan a los sitios antigénicos distribuidos sobre la superficie de la membrana eritrocitaria, actuando como anclajes moleculares para unir células adyacentes y formas aglutinadas. Una pequeña cantidad de energía es disipada durante la reacción. Si se suministra una cantidad de trabajo mecánico equivalente a la energía disipada, los aglutinatos pueden ser disociados. El trabajo mecánico es realizado por tensiones de corte generadas en un viscosímetro de tipo Couette. Se propone una nueva técnica que utiliza la retrodifusión de un haz láser para analizar la cinética de disociación de aglutinatos eritrocitarios inmunológicos, producida por cizallamiento de los aglutinatos en suspensión. La intensidad del láser, retrodifundida, aumenta en la medida que los aglutinatos son disociados por corte. El registro de la intensidad retrodifundida suministra una curva de disociación que es ajustada por una ecuación exponencial. Los parámetros que caracterizan esta ecuación muestran una buena correlación con la potencia de la aglutinación. La integración numérica de las curvas de disociación conduce a la obtención de un parámetro ED que estima la energía intercambiada en el proceso de disociación y, en consecuencia, la constante de afinidad.
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Comunicação Celular , Agregação Eritrocítica/imunologia , Hemorreologia , Reação de Imunoaderência/métodos , Separação Celular/métodos , Termodinâmica , Dissipação de Energia , LasersRESUMO
Human erythrocytes have a well-defined lifespan of 120 days. Their eventual removal from circulation is a complex process affected by many cellular parameters, making them susceptible to sequestration in the spleen and other organs. The purpose of this study was to investigate putative changes in rheologic properties, antigenic expression and interaction with monocytes of senescent erythrocytes (SE). SE and young erythrocyte (YE) fractions were obtained by differential centrifugation from 20 healthy donor blood samples. Membrane rheomechanic properties (by difractometric method), ABO and MN antigens reactivity and erythrophagocytosis by peripheral monocytes were investigated in each fractions. SE showed a little decrease in the deformability index and an increase of both membrane elastic modulus and surface viscosity. The studies performed indicate a decreased expression in the antigens of both blood group systems studied (p < 0.01) and an increased rate of erythrophagocytosis by monocytes in SE compared to YE (p < 0.01). The significant modifications in the biomechanic properties of senescent red blood cell membrane and the loss antigenic expression could lead to physiological phagocytosis.
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Humanos , Comunicação Celular/fisiologia , Envelhecimento Eritrocítico/fisiologia , Monócitos/fisiologia , Reologia , Viscosidade Sanguínea , Envelhecimento Eritrocítico/imunologia , Fagocitose/fisiologiaRESUMO
El objetivo de este trabajo fue determinar la presencia de anticuerpos del sistema ABO em 119 muestras de sangre de cordón de recién nacidos de grupo 0, cuyas madres presentaban el mismo grupo. Posteriormente se titularon los anticuerpos anti-A mediante un método manual de cuantificación de la aglutinación, relacionándolos con los anticuerpos presentes en la madre respectiva. Los resultados obtenidos demuestran la presencia de anticuerpos del sistema ABO en sangre de cordón umbilical en un 93,3% de las muestras (n = 111). Del total de estas muestras con reacción positiva, el 96,4% (n = 107) permaneció activo después del tratamiento con 2-mercaptoetanol, evidenciando su naturaleza de iunmunoglobulina G. La cuantificación de los anticuerpos anti-A demostró una menor concentración en los bebés que en la madre respectiva. Además, se observó que los bebés con títulos altos correspondían a las madres que presentaban títulos mayores. El análisis estadístico (r de Spearman) indicó que existe una asociación entre ambas variables
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Recém-Nascido , Humanos , Sistema ABO de Grupos Sanguíneos/imunologia , Anticorpos/análise , Cordão Umbilical/análise , Incompatibilidade de Grupos Sanguíneos/análise , Anticorpos/análise , Imunoglobulina G/análise , Imunoglobulina M/análiseRESUMO
La determinación cuantitativa de tamaños y formas de partículas en suspensión por medio de la difusión lumínica, ha sido aplicada para desarrollar tres nquevos métodos para estudios inmunohematológicos. El primero de ellos es un método manual para cuantificar reacciones de hemaglutinación, rápido y fácil de ejecutar. Su precisión y repetibilidad han sido bien demostradas. En el segundo método se determina la velocidad de aglutinación, midiendo la disminución de la difusión lumínica total. Con el tercer método se mide la deformabilidad de los eritrocitos en suspensión, sometidos a un campo de corte fluido, por medio del patrón de difracción producido por un laser qque atraviesa la mquestra. Con los datos obtenidos por este método se calculan dos parámetros reológicos (un coeficiente de elasticidad de membrana y un coeficiente de viscosidad superficial de la membrana). Significativas modificaciones de los parámetros reológicos con relación a valores normales fqueron observados cuando se colocaron los eritrocitos en presencia de anticquerpos específicos. Las modificaciones observadas nos conducen a especular respecto del nivel topográfico de la membrana alterado por el anticquerpo. Se presenta un caso de enfermedad hemolítica autoinmune, que mquestra la sensibilidad de este método para el diagnóstico clínico
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Humanos , Deformação Eritrocítica , Eritrócitos/fisiologia , Hemaglutinação/métodos , Técnicas In Vitro , Aglutinação , DifusãoRESUMO
La medición de viscosidad plasmática y de sangre entera, determinadas en un viscosímetro rotacional, fue utilizada para verificar la existencia de anormalidaes hemorreológicas en pacientes diabéticos e hipertensos. Dichas mediciones se realizaron a distintas velocidades de corte, con lo cual se trazaron los correspondientes reogramas. Con esos datos se calcularon las correspondientes viscosidades relativas. Los resultados obtenidos, comparados con valores de los mismos parámetros obtenidos en individuos normales, permitiernon detectar comportamientos anormales, característicos de esas patologías circulatorias. Las diferencias más significativas se obtuvieron a una velocidad de corte de 5,76 seg. Se concluye que, en los pacientes diabéticos, los factores plasmáticos tienen mayor influencia en la aparición de hiperviscosidad, mientras que en los pacientes hipertensos son más influyentes los factores globulares
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Humanos , Masculino , Feminino , Viscosidade Sanguínea , Hemorreologia/estatística & dados numéricos , Diabetes Mellitus/sangue , Hemorreologia , Hipertensão/sangueRESUMO
La incorporación de colesterol (hemisuccinato de colesterol) a la membrana eritrocitaria afecta sus propiedades reológicas. Esta influencia ha sido evaluada a través de dos parámetros reológicos característicos de la membrana celular: la deformabilidad celular y la fragilidad osmótica. Para ello se aplicaron dos técnicas ambas basadas en el fenómeno de difracción láser, cada una de las cuales presenta diferente sensibilidad de respuesta. Se aplicaron dos protocolos de incubación (12 h a 25ºC el primero y 12 h a 25ºC + 12 h a 37ºC el segundo); en cada uno de ellos se fue variando la cantidad de colesterol incorporado, expresado como Tasa Colesterol/Proteína (Tcp = 0,18 a 0,83). La alteración de las propiedades reológicas de la membrana eritrocitaria producida por la incorporación de colesterol se traduce por una reducción de la deformabilidad celular y por un aumento de la fragilidad osmótica. Se observó que tanto la deformabilidad como la fragilidad, aparecen en relación inversa a la concentración de colesterol incorporado. Sin embargo, deben considerarse que tipos diferentes de deformación se aplican en cada técnica: transformación a esferocito en la fragilidad osmótica y cisallamiento en la deformabilidad