Analysis of α4ß1 Integrin Specific Antagonists Binding Modes: Structural Insights by Molecular Docking, Molecular Dynamics and Linear Interaction Energy Method for Free Energy Calculations

A integrina VLA-4 (integrina a4b1) participa da fisiopatologia de uma grande variedade de doenças, incluindo asma, esclerose múltipla, artrite reumatóide e diabetes. A seletividade de ligantes por essa integrina permanece ainda um problema sem resposta, principalmente devido ao fato das estruturas 3D da maioria delas serem ainda desconhecida. Inicialmente, construímos um modelo computacional tridimensional do sítio ativo da integrina a4B1, utilizando a estrutura cristalográfica da integrina aVb3 como molde. Após, realizamos um estudo por docking molecular usando um conjunto de sete antagonistas de a4b1 derivados de 4-[N'-(2-metilfenil) ureido]fenilacetil, avaliando os seus modos de ligação. A técnica de dinâmica molecular foi utilizada de modo a aumentar a eficiência da exploração do perfil energético obtido pelo algoritmo de docking. Segundo a nossa análise, os compostos foram sistematicamente agrupados em dois modos de ligação principais, sendo a conformação estendida o modo prevalente de ligação dos antagonistas no sítio. Cálculos de energia livre também confirmaram essa constatação. Esse estudo aumenta a compreensão dos mecanismos de ligação dessa família de antagonistas e pode fornecer informações úteis ao desenho racional de fármacos específicos para o VLA-4.

Identificação e validação de antagonistas potenciais de APRIL através da aplicação de cálculos de energia livre e dinâmica molecular

O ligante APRIL (do inglês: A Proliferating Inducing Ligand) foi descrito pela primeira vez por Hahne et al, em 1998, e inicialmente caracterizado pela sua capacidade de estimular a proliferação de células tumorais in vitro. Atualmente, três receptores para APRIL são conhecidos: B-Cell Maturation Antigen (BCMA), Transmembrane Activator and CAML Interactor (TACI), os quais são expressos principalmente por linfócitos B, e Heparan Sulphate Proteoglycan (HSPG). BCMA e TACI também são capazes de se ligar ao ligante B-Cell Activation Factor (BAFF), outra proteína da família TNF que compartilha uma alta similaridade estrutural com APRIL. Recentes descrições de camundongos deficientes em APRIL mostraram que essa proteína não é essencial para a manutenção da homeostase do sistema imune saudável, estando associada somente à proliferação de células tumorais, enquanto BAFF é um fator de sobrevivência fundamental para a maturação de linfócitos B. Dessa maneira, como BAFF é um fator crucial para o funcionamento do sistema imune, bloquear a interação de BAFF irá afetar a homeostase imunológica, comprometendo a imunidade do indivíduo. O objetivo desse trabalho é gerar uma série de peptídeos antagonistas de APRIL, combinando ferramentas computacionais e experimentais. Através da combinação de "Alanine Scanning" computacional com cálculo de energia livre utilizando "Linear Interaction Energy" (LIE) nos complexos APRIL-TACI e BAFF-TACI, foi possível determinar a importância de cada resíduo na estrutura de TACI, apontando a contribuição energética individual para a especificidade da ligação APRIL-TACI. Os coeficientes padrão de LIE foram utilizados. A partir dos resultados de LIE, foram desenhados seis peptídeos mutados, tendo TACI como modelo, com potencial atividade inibitória para APRIL, sem interferir com a estrutura de BAFF:T8: CRKELLKFYDHLLEDCISCANICGQHPRQCAYFC T9: CRKEQFKFYDHLLDDCISCAQICGQHPHQCAYFC T10:CRKEQFKFYDHLLDDCISCAQTCGQHPHQCAYFC T11:CRKEQFKFYDELLDDCISCAQICGQHPHQCAYFC xv T12:CRKELFKFYDHLEDDCISCAQTCGQHPHQCAYFC T13:CRKELFKFYDHLEDDCISCAQSCYQHQHQCAYFC A estabilidade dos peptídeos foi analisada por dinâmica molecular em complexo com os dois ligantes, APRIL e BAFF, através da avaliação da estrutura secundária ao longo de 30 nanosegundos, quantificação das ligações hidrogênio e pontes salinas, e medição da superfície acessível ao solvente. Após a dinâmica molecular, os melhores candidatos foram escolhidos em função do aumento do número de pontes de hidrogênio e pontes salinas formadas com APRIL. Os peptídeos T12 e T13 foram excluídos devido à perda da estrutura secundária inicial. Os quatro melhores candidatos, do ponto de vista computacional, foram clonados em bactérias e os plasmídeos foram transfectados em células eucarióticas 293T. Seguiu-se então a purificação do sobrenadante produzido pelas células transfectadas. O sucesso da transfecção foi confirmado por imunoblotting. A atividade inibitória desses peptídeos foi testada por ELISA após a purificação. Dentre os quatro peptídeos, dois foram capazes de reduzir sensivelmente a densidade ótica, indicando que houve efeito inibidor para esses peptídeos. Os resultados apontam que a estratégia elaborada nesse trabalho pode ser aplicada ao desenho de sequências peptídicas direcionadas à inibição de um alvo proteico específico.

Generation of a scFv antagonistic to VLA-4 integrin as potential therapeutic target in muscular dystrophies: in silico phase

As integrinas α4ß1 ou VLA-4 são encontradas em membranas de monócitos e linfócitos T. A sua participação na migração de leucócitos é crucial para doenças inflamatórias. Além disso, essas proteínas também são encontradas em mioblastos e participam do processo de regeneração muscular. Portanto, VLA-4 é um alvo terapêutico importante para doenças como distrofias musculares, que estão associadas ao processo inflamatório. ScFvs, Variável de Fragmento de Cadeia Única, são fragmentos de anticorpos que conservam as regiões hipervariáveis de cadeias leves e pesadas, preservando sua especificidade. Atualmente, o único anticorpo comercialmente disponível, que interage com as integrinas α4ß1, é Natalizumab. No entanto, Natalizumab não é específico para α4ß1. Também reconhece integrinas α4ß7. Além disso, sua aplicação não é totalmente segura. Neste contexto, este trabalho teve como objetivo construir um scFv específico para integrinas α4ß1 através de ferramentas in silico e, posteriormente, ferramentas in vitro.

Modelagem, docking e dinâmica molecular de dois fragmentos de anticorpos contra o antígeno de superfície do vírus da Hepatite B

A hepatite B, um dos grandes problemas de saúde pública atuais, pode levar pacientes crônicos a um transplante de fígado seguido de tratamento com imunossupressores administrados conjuntamente a anticorpos monoclonais. Fragmentos variáveis de cadeia única (scFv) são produtos de anticorpos adequados para esse tipo de tratamento. Desta forma, este trabalho apresenta o início do processo de humanização de dois clones de anticorpos monoclonais murinos, 19DD1AE3 e 19CC6CG2, obtidos pelo Laboratório de Tecnologia de Anticorpos Monoclonais da Fundação Oswaldo Cruz.